ICS67.080 B23 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T1962-2010 马铃薯纺锤块茎类病毒检测 Detection of potato spindle tuber viroid (PSTVd) 2010-12-23发布 2011-02-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T1962-2010 马铃薯纺锤块茎类病毒检测 1范围 本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的检测方法. 本标准适用于马铃薯种薯、商品薯、试管苗及其根、茎、叶不同部位组织中的马铃薯纺锤块茎类病毒 的检测. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 方法一聚合酶链式反应 3原理 类病毒是没有外壳蛋白、裸露的、低分子闭合环状RNA分子，RNA分子大小在246nt~401nt之 间，马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的序列在356nt~360nt之间.根据PSTVd序列设计特异性引 物，进行扩增，扩增片段大小为359bp左右. 4试剂与材料 以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水. 4.1三氯甲烷. 4.2M-MLV反转录酶(200u/L). 4.3RNA酶抑制剂(40u/L). 4.4 Tag DNA聚合酶(5u/L). 4.5焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水. 在100mL水中，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)50L 室温过夜，121℃高压灭菌20min 分装到1.5 mL DEPC处理过的微量管中. 4.63mol/L乙酸钠溶液(pH5.2). 称取乙酸钠3Hg024.6g 加水80mL溶解，用冰乙酸调pH至5.2，定容至100tmL 4.7水饱和酚(pH4.0). 4.8溴化乙锭溶液(10mg/mL) 称取溴化乙锭200mg 加水溶解，定容至20mL. 4.91mol/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HC)溶液(pH8.0). 称取Tris碱121.1g 溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL 121℃高 压灭菌20min. 4.10RNA提取缓冲液. 称取Tis碱12.12g 氯化钠5.88g 乙二胺四乙酸二钠3.75g 加水至900mL 溶解，用浓盐酸调 NY/T1962-2010 pH至9~9.5，加水定容至1000mL 121℃高压灭菌20min. 4.110.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0). 称取乙二铵四乙酸二钠186.1g 溶于700mL水中，用氢氧化钠调H至8.0，加水定容至1000 mL. 4.125 XTris-硼酸(TBE)电泳缓冲液. 称取Tis碱27g 硼酸13.75g 量取0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(4.11)10mL 加灭菌双蒸 水400mL溶解，定容至500mL. 4.131 XTris-硼酸(TBE)电泳缓冲液. 量取5 XTris-硼酸(TBE)电泳缓冲液(4.12)200mL 加水定容至1000mL. 4.14加样缓冲液. 分别称取聚蔗糖25g 溴酚蓝0.1g 二甲苯腈0.1g 加水至100mL. 4.155×反转录反应缓冲液. 量取1mol/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HCI)溶液(4.9)5mL 0.559g氯化钾，0.029g氯 化镁，0.154g二硫苏糖醇(DTT) 加水定容至100mL. 4.1610mmo...
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