中华人民共和国国家标准
GB/T 36818-2018
Detection and identificationof Gremmeniella abietina(Lagerberg）Morelet
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：王额、程颖慧、汪莹、章桂明、高瑞芳、李芳荣、史亚千、郑耘、封立平.
冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了冷杉枯稍病菌[Gremmeniella abietina（Lagerb.）M.Morelet]的检疫鉴定方法.本标准适用于冷杉枯梢病菌寄主及其产品携带冷杉枯梢病菌的检疫鉴定.
2基本信息
中文名：冷杉枯梢病菌
英文名：Scleroderris canker
学名:Gremmeniella abierina (Lagerb.) MMorelet
异名: Ascocalyr abietina ( Lagerb.) Schlapf.-Bernh. Craenula abietina Lagerb. C Pinea ( P.Karst.)Ferd. &. C.A.Jorg. Godronia abietina (Ellis &. Everh.) Seaver Grewweniella abietina var.abi-etina (Lagerb.) M.Morelet G.abietina var.balsame Petrini L.E.Petrini Lafl.&. Ouell Lagerbergia abietine (Lagerb.)J. Reid ex Dennis Pragwopora αbietina (Ellis &. Everh.) J. W.Groves Scleroderrisabietina ( Lagerb )Gremmen S.fagerbergii Gremmen.
无性态：Brunchorstia pinea （P.Karst.）Hohn.
Morelet B.pini Allesch. B pinea var pinea (P.Karst ) Hohn.Ercipulina pinea (P.Karst.) Hohn. 无性态异名：Brunchorstia destruees Erikss. B.pinea (P.Karst.） Hohn. B.pineu var.cerae M.Se ptoria pinea P.Karst.
分类地位：真菌界（Fungi）、子囊菌门（Asycota）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、柔膜菌目（Helotia-les）、柔膜菌科（Helotiaceae）Gremmeniella属.
传播途径：冷杉枯梢病菌主要通过水滴扩散进行近距离由传播，远距离由风或病残体传播.
近似种=Sphaeropsis sa pinea Crumenulopsis sororia Grenmeniella laricina Cenangium ferrug-inOsum .
冷杉枯精病菌的其他信息参见附录A.
3方法原理
冷杉枯梢病菌的病害症状与形态学特征是鉴定该病菌的主要依据.
4仪器及用具
4.1仪器
烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、光照培养箱、天平（感量1/100g）、冰箱、超净工作台等.
4.2用具
筒、吸管、酒精灯、滤纸等. 样品袋、标签、放大镜、培养Ⅲ、载玻片、盖玻片、三角瓶、试管、烧杯、手术刀、手术剪、镊子、研钵、量
5试剂
5.1试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.1%次氯酸钠溶液、无水乙醇、75%乙醇、无菌蒸馏水.V8汁、麦芽提取物、马铃薯、琼脂、小麦.
5.2培养基
V8汁麦芽提取物培养基、小麦培养基、PDA培养基，配方参见附录B
6病原菌鉴定
6.1症状检查
在芽、针叶、枝条或茎上出现橘色至褐色病斑，受侵严重时会出现细弱、扭曲的嫩枝或丛枝，甚至造成枝条枯死，树干上则会形成溃疡斑.在病斑上的黑色小点为病菌的分生孢子器，在茎或针叶上单生或聚生，深福色至黑色，子座状，有时连成一片，约1mm大小.子囊盘一般出现在树皮、死亡枝条或针叶基部，聚生表面开口，有短柄在潮湿条件下呈奶油色或浅灰色.
将可疑样品带回实验室做进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息.
6.2直接镜检
行镜检及病原菌的分离培养. 将有成熟子实体的病枝或针叶置于体视显微镜下检查，挑取病部子实体制成玻片，置于显微镜下进
6.3保湿培养
将有上述症状但无子实体的组织，进行保湿培养，将枝条或针叶置于密闭的塑料盒或袋中，17℃下每天16h光照/8h黑暗交替培养，待发现子实体时，进行显微镜检及病原菌的分离培养.
6.4分离培养
6.4.1针叶上病原菌的分离培养
将针叶从树梢上取下，用自来水冲洗30min，1%的次氯酸钠表面消毒10min，无菌水冲洗3次，在灭菌滤纸上晾干，剪成3mm长小片，置于水琼脂培养基中5℃~10C黑暗培养3周左右，待长出菌丝后转到V8汁麦芽提取物培养基上17C每天16h/8h黑暗交替培养.
6.4.2树梢、树枝及茎干上病原菌的分离培养
取树梢、树枝及茎干的发病部位，用自来水冲洗30min.1%的次氯酸钠表面消毒10min，无菌水冲洗3次，在灭菌滤纸上晾干，剥去树梢、树枝及茎干的外皮，剪成3mm长小片，置于水琼脂培养基5℃～10C黑暗培养3周左右，待长出菌丝后转到V8汁麦芽提取物培养基上17C每天16h/8h黑暗交培养.
如果不产孢，也可将病菌接种到小麦培养基上刺激产孢.
6.4.3病菌形态特征和培养性状观察
观察记录病菌的培养性状、形态特征包括菌落的生长速度、颜色变化、孢子的形成情况、产孢方式等.
7鉴定特征
7.1病菌培养性状
冷杉枯梢病菌在V8汁麦芽提取物培养基上生长缓慢菌落白色、绿色或灰绿色，有时产生黄色的气生菌丝，参见附录C.病菌生长的最低温度为一5C，最高温度为30C，最适生长温度在13℃～20℃之间.
7.2病菌形态
分生孢子器深褐色至黑色，子座状，多腔，无孔口：分生孢子器壁厚度为儿个细胞大小，由外部硬化的深色细胞和内部的拟薄壁组织组成.分生孢子梗在分生孢子器内排成一行，透明、圆柱状：分生孢子 （芽生孢子）无色透明、梭形，分生孢子两端稍弯，具3个～7个隔膜，多数三隔，分隔处不缓缩，大小(25 μm~ 40 μm) ×(3 μm~3.5 μm).
子囊盘聚生，表面开口，有短柄，子囊层奶油色，子座深褐色至黑色，边缘不明显.囊盘被由儿层深色的多边形细胞组成，向边缘硬化，不规则的细胞向外突出.子囊稍棒形，具短柄，无囊盖，内含8个子囊孢子，（100μm~120μm）×（6.5pm~10.5μm），子囊双囊壁，子囊孢子双列，无色，椭圆形，有时稍 弯曲，末端圆形，成熟孢子三隔，分隔处不绪缩，（15μm~22μm）×（3μm~5m）.侧丝无色，丝状，具分隔.参见附录D.
7.3与近似种及引起相似症状的病菌的区别
G.abietina 的近似种主要是松树桔椭病菌Sphaeropsis sapinea、Cr.sororia、G.laricina、红松烂皮病菌Ce.ferruginosum.冷杉枯椭病菌与其近似种的形态学的主要区别为：
S.sapineα分生孢子很大，（30μm~45μm）×（10pm~16μm）深褐色.Cr.sororia分生孢子指状，子囊座黑色，边缘明显，具黑色刚毛.G.laricina分生孢子较短，（15μm~23 μm）×（3 μm~4μm），1隔~3隔；子囊孢子1隔. Ce.ferruginosum子囊孢子无分隔，椭圆形.
8结果判定
病害症状符合6.1、病菌形态学特征符合第7章则可判定为冷杉枯稍病菌（Gremeniellaabierina）.
9样品保存与处理
保存1年，以备复验.保存期满后，需经灭菌处理. 保存样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月，如发现冷杉枯椭病菌，该样品应
10菌种保存与处理
菌株在含30%甘油的冻存管中于一80℃保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜
