中华人民共和国国家标准
GB/T36861-2018
饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法
Determination of activity of β-mannanase as feed additive-Spectrophotometricmethod
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国何料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口.本标准起草单位：浙江大学饲料科学研究所、浙江明珠动物保健品有限公司. 本标准主要起草人：邹晓庭、吴琪、周樱、王小骊、祝春雷、刘国花、谢红云、王风芹、蒋媛婧、方洛云.
饲料添加剂甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法
1范围
本标准规定了测定何料添加剂β-甘露聚糖酶活力的分光光度方法.本标准适用于饲料添加剂β-甘露聚糖酶及其复合酯.本方法的定量限为10U/g-
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
β-甘露聚糖酶活力单位β-mannanase activityunit
需要的酶量为一个β-甘露聚糖酶活力单位（U）. 在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中释放1μmol还原糖所
4原理
β-甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖.还原性寡糖和单糖在沸水浴中与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β甘露聚糖酶的活力成正比.通过分光光度计比色测定反应液的吸光度，计算出β甘露聚糖酶的活力.
5试剂或材料
除非另有说明，试剂均为分析纯.
5.1水：符合GB/T6682中二级水的规定. 5.2氢氧化钠溶液（200g/L）：称取20.0g氢氧化钠，加水溶解，定容至100mL.5.3乙酸溶液（0.1mol/L）：取冰乙酸0.60mL，加水稀释，定容至100mL.5.4乙酸钠落液（0.1mol/L)：称取1.36g三水乙酸钠，加水溶解，定容至100mL.5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L，pH5.5）称取23.14g三水乙酸钠，加人1.70mL冰乙酸，再加 水溶解，定容至2000mL.测定溶液的pH，如果pH偏离5.5，用乙酸溶液（5.3）或乙酸钠溶液（5.4）调节至5.5.5.63，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取3，5-二硝基水杨酸（化学纯）3.15g，加水500mL，45C水浴中搅拌5s.然后缓慢加人100mL氢氧化钠溶液（5.2）.不断搅拌，直到溶液清澈透明（在加人氢氧化钠过程中，溶液湿度不要超过48℃）.再逐步加人91.00g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚
硫酸钠.继续45℃水浴加热，补加水300mL，不断搅拌，直到完全溶解.冷却至室温后，用水定容至1000mL.过滤，取滤液，储存在棕色塑料瓶中，避光保存.室温下存放7d后使用，有效期为6个月.
5.7甘露聚糖溶液（6mg/mL）：称取0.600g甘露聚糖（Sigma G0753），精确到o.001g，加人80mL30min，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）定容至100ml.4C避光保存，有效期为3d，使用前应搅拌 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5），磁力搅拌，间断性加热，直至甘露聚糖完全溶解，停止加热，继续搅拌均匀，
5.8D-甘露糖标准贮备溶液：精确称取预先在105℃干燥至恒重的1.000gD-甘露糖，加乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）溶解，定容至100mL，得到10.0mg/mLD-甘露糖标准贮备溶液.
5.00mL.6.00mL和7.00mL，分别置于100mL容量瓶中，用乙酸-乙酸钠缓冲液（5.5）定容，摇匀，配制 5.9D-甘露糖标准系列溶液：吸取D-甘露糖标准备溶液（5.8）1.00mL2.00mL、3.00mL、4.00mL、成 D-甘露糖标准工作溶液，浓度为 0.10 mg/mL 0.20 mg/mL 0.30 mg/mL 0.40 mg/mL 0.50 mg/mL、0 60 mg/mL↓0.70 mg/mL
6仪器设备
6.1分样筛：孔径为0.25mm 6.2分析天平：感量0.1mg6.3pH计：精度为±0.01.6.4磁力搅拌器：附加热功能.6.5恒温水浴锅：37C6.6秒表：每小时误差不超过5s 6.7分光光度计：吸光度540nm6.8离心机：离心力不低于为2000g.
7试验步骤
7.1标准曲线绘制
吸取缓冲液（5.5)4.0mL，加入DNS试剂（5.6）5.0mL，沸水浴加热5min.用水冷却至室温，用水定容至25mL，制成试剂空白溶液.
行），再分别加人2mL乙酸-乙酸钠缓冲液（5.5）和5mLDNS试剂（5.6）.用手微振，沸水浴加热5min， 分别吸取D-甘露糖标准系列溶液（5.9）各2mL，加人至25mL刻度试管中（每个浓度做2个平取出迅速用水冷却至室温，再用水定容至25mL.以试剂空白溶液调零，在540nm处测定吸光度（A值）.以D-甘露糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线，获得线性回归方程.
每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.
7.2试样酶液的制备
7.2.1固态样品
固态试样应粉碎或充分碾碎，过0.25mm孔径筛.称取适量试样两份，精确至0.0001g，分别置于200mL锥形瓶中，加人100mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）.摇床或磁力搅拌提取30min，上离心机4000r/min离心5min，取上清液，上清液再用缓冲溶液（5.5）做二次稀释，使稀释后的待测酶液中β-甘 露聚糖酶活力控制在0.04U/mL~0.08U/mL之间.
7.2.2液态样品
活力控制在0.04U/mL~0.08U/mL之间.如果稀释后酶液的pH偏离5.5，应用乙酸溶液（5.3）或乙 酸钠溶液（5.4）调整校正至5.5，再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）适当稀释并定容.
7.3测定
7.3.1移取10.0mL待测酶液，置于具塞试管内.37℃±0.2℃C水浴10min.
7.3.2称取2g（精确至0.01g）甘露聚糖溶液（5.7），至25mL刻度试管中.37C±0.2C水浴10min，加人5mLDNS试剂（5.6），振摇3s，加人2mL经过37℃±0.2℃平衡的待测酶液，振摇3s，37C土0.2C保温30min，沸水浴加热5min，取出，迅速用水冷却至室温，加水定容至25mL混匀.以 试剂空白溶液调零，用10mm比色Ⅲ，在540nm处测定样品空白溶液吸光度（A.）.
7.3.3称取2g（精确至0.01g）甘露聚糖溶液（5.7），加人到25mL刻度试管中，37C土0.2C平衡10min，加人2mL经过适当稀释的酶液（已经过37C±0.2C平衡），振摇3s，37C±0.2C精确保温30min，加人5mLDNS试剂（5.6），振荡混匀，沸水浴加热5min，取出，迅速用水冷却至室温，加水定容 至25mL混匀.以试剂空白溶液为空白对照，在波长540nm下，测定样品管中样液的吸光度（A），通过线性回归方程计算β甘露聚糖酶的活力.
8试验数据处理
试样稀释液中β-甘露聚糖酶活力以X.表示，单位为酶活力单位每毫升（U/mL），按式（1）计算：
式中：
A 样品管的吸光度；A样品空白管的吸光度； 标准曲线的斜率；一标准曲线的截距；M D-甘露糖的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)(M=180.2g/mol）：30一酶解反应时间，单位为分（min）；
1000单位换算系数.
X值应在0.04U/mL~0.08U/mL之间.如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定.
试样β-甘露聚糖酶的活力以X表示，单位为酶活力单位每克（U/g）或者酶活力单位每毫升（U/mL），按式（2）计算：
式中：
X--试样稀释液中β甘露聚糖酶活力，单位为酶活力单位每毫升（U/mL）：
-试样的总稀释倍数.
计算结果保留三位有效数字.
9精密度
在重复性条件下，两次独立测定结果绝对差值不超过其算术平均值的10%.
