中华人民共和国国家标准
GB/T 35336-2017
Detection and identification ofApplefruitcrinkleviroid
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.本标准主要起草人：邓丛良、赵晓丽、吕玉峰、梁新苗、骆卫峰、郑春生、张永江.
苹果皱果类病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了苹果皱果类病毒的检疫鉴定方法.本标准适用于可能带有苹果皱果类病毒的植物材料的检测鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3苹果皱果类病毒基本信息
学名：Apple fruit crinkle viroid.缩写：AFCVd.分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae）、苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）.
苹果皱果类病毒的其他信息参见附录A.
4方法原理
类病毒检测主要针对其核酸序列.主要的方法有RT-PCR和核酸分子杂交.
5仪器设备、主要用具和主要试剂
5.1仪器设备
电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80C）、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电浴锅、组织破碎仪等. 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、恒温水
5.2主要用其
可调移液器（2.5pL、10L20μL 200μL、1000μL、5000μL）、无RNA酶吸头（10pL20L、200μL、1000μL、5000μL）无RNA酶离心管（1.5mL、5mL、10mL）、研钵、研棒、磁性分离架、PCR 反应管（200μL）、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片.
5.3主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定，RT-PCR检测试剂见附录B：实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C；斑点杂交检测试剂见附录D.
GB/T 35336-2017
6检测与鉴定
6.1普通RT-PCR检测方法
普通RT-PCR检测方法见附录B.
6.2实时荧光RT-PCR检测方法
实时荧光RT-PCR检测方法见附录C.
6.3斑点杂交检测方法
斑点杂交检测方法见附录D.
7结果判定
样品经普通RT-PCR检测为阳性，且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性，则判定为检出苹果皱果类病毒.
样品经普通RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的AFCVd序列一致，则判定为检出苹果皱果类病毒，
样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的AFCVd序列一致，则判定为检出苹果皱果类病毒，
8样品保存与结果记录
8.1样品保存
样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月，种子保存在4C冰箱内，生长苗木或插条保存在隔6个月，以备复核、谈判和仲裁.保存期满后，应灭活处理. 离温室中培养，叶片、果实等样品在一80C冰箱内保存.对检出苹果皱果类病毒的样品应至少保存
8.2结果记录
完整的实验记录要包括样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字；普通RT-PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图及Ct 值，斑点杂交检测保存照片，序列测定结果保存测序报告图.
附录A
（资料性附录）苹果皱果类病毒相关资料
A.1寄主范围
自然条件下侵染苹果（Maluspumila）和啤酒花（Humarlus laparlus）.
A.2病害症状
苹果受AFCVd侵染后，其典型的症状表现为果实粗皱缩、果肉坏死，另外一些品种被感染后树皮也会发生异常，如出现疱疹或枝条末梢枯死等.AFCVd侵染啤酒花会造成藤蔓的矮化、卷叶和皱缩 等症状.
A.3分布地区
日本.
A.4传播方式
AFCVd主要通过嫁接、芽接和机械传播.
A.5基因组
AFCVd为单链环状的RNA分子，长368个~372个核苷酸残基，存在于细胞核内，非对称性滚环复制.
