中华人民共和国国家标准
GB 5009.206-2026
食品安全国家标准
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB5009.206-2016（食品安全国家标准水产品中河豚毒素的测定》.本标准与GB5009.206-2016相比，主要变化如下：修改了标准的适用范围： 将标准名称修改为《食品安全国家标准水产品及其制品中河豚毒素的测定》：修改了液相色谱-质谱/质谱法的提取和净化前处理方法.
食品安全国家标准
水产品及其制品中河豚毒素的测定
1范围
本标准规定了水产品及其制品中河豚毒素的测定方法.本标准第一法液相色谱法和第三法小鼠生物法适用于鱼类中河原毒素的测定.第二法液相色谱质谱/质谱法适用于水产品及其制品中河脉毒素的测定.第四法酶联免疫吸附法适用于鱼类中河豚毒素的筛查测定.
第一法液相色谱法
2原理
试样经酸性甲醇溶液提取，免疫亲和柱净化，液相色谐-柱后衍生荧光检测器检测，外标法定量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
3.1试剂
3.1.1甲醇（CHOH)3.1.2乙晴（CHCN）：色谱纯.3.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯.3.1.4冰乙酸（CHCOOH）. 3.1.5乙酸铵（CHCOONH）：色谱纯.3.1.6十二水合磷酸氢二钠（NaHPO12HO）.3.1.7二水合磷酸二氢钠（NaHPO2HO）.3.1.8氯化钠（NaCl). 3.1.9氢氧化钠（Na（OH）.3.1.10庚烷磺酸钠（C H；NaOS）.
3.2试剂配制
3.2.21%乙酸甲醇溶液：量取1mL冰乙酸用甲醇稀释至100mL，混匀. 3.2.11%乙酸溶液：量取1mL冰乙酸用水稀释至100mL.混匀.3.2.32%乙酸甲醇溶液：量取2mL冰乙酸用甲醇稀释至100mL，混匀.3.2.4磷酸盐缓冲液（PBS溶液）：分别称取6.45g十二水合磷酸氢二钠、1.09g二水合磷酸二氢钠、4.25g氯化钠，用水溶解并稀释至500mL，混匀.3.2.5乙酸铵缓冲液：称取4.6g乙酸铵和2.02g庚烷磺酸钠，加人约700mL水溶解，用冰乙酸调节
GB 5009.206-2026
3.2.6氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取4.0g氢氧化钠，用水溶解并稀释至100mL，混匀. pH至5.0，用水稀释至1000mL，混匀.3.2.7氢氧化钠溶液（4mol/L）：称取160g氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000mL，混匀.
3.3标准品
河豚毒素（CHNO，CAS号：4368-28-9）：纯度≥98%的标准品或其溶液.
3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备液（100mg/L）：准确称取1mg（精确至0.01mg）河豚毒素标准品，用1%乙酸溶液溶 解并定容至10mL，混匀.一18℃及以下温度条件密封避光保存，有效期12个月.匀.一18℃及以下温度条件密封避光保存，有效期6个月.3.4.3标准系列工作液：吸取标准中间液适量，用1%乙酸溶液配制成质量浓度分别为300μg/L、 500μg/L、1 000μg/L、2 000μg/L、5000μg/1的标准系列工作溶液.临用现配.
3.5材料
3.5.1河豚毒素免疫亲和柱：柱容量≥2500ng.柱回收率≥85%.3.5.2微孔滤膜：0.22pm，水系.
4仪器和设备
4.1液相色谱：配有荧光检测器与柱后衍生装置.4.2电子天平：感量分别为0.01mg和0.01g. 4.3离心机：≥8 000 r/min.4.4固相萃取装置.4.5涡旋混合器.4.6超声波发生器.4.7高速粉碎机. 4.8组织接碎机.4.9氮吹仪.
5分析步骤
注：高浓度中毒样品检测时，废弃的提取液应在氢氧化钠溶液（1mol/L）中浸泡1h以上，以使毒素分解.下同.
5.1试样制备与保存
5.1.1试样制备
可剪切成小块经冷冻后立即用高速粉碎机处理. 将样品清洗后取可食部分不少于400g，剪切成小块后，用组织接碎机接碎并混合均匀.河豚鱼皮
注：根据检验目的可按实际情况取样制备.
5.1.2试样保存
2 制备后混合均匀的样品均分至约100g的多个包装，储存于洁净的容器内，密封后一18℃及以下
避光保存.
5.2试样提取
称取2g（精确到0.01g）试样置于50mL聚丙烯离心管中，加入1%乙酸甲醇溶液10mL，涡靛振荡2min，60C水浴超声提取30min，4500r/min离心5min.上清液于60℃旋转蒸发浓缩至近干，加1%乙酸溶液2mL溶解残渣，混匀.取1mL复溶液至10mL聚丙烯离心管中.加人8mLPBS溶液稀 释，用氢氧化钠溶液（1mol/L）调节pH至7~8，待净化.
5.3试样净化
亲和柱.稀释液流尽后，用10mL水淋洗，适当加压挤干柱内液体.用2%乙酸甲醇溶液4mL洗 待免疫亲和柱恢复至室温，原有液体流尽后，以约1滴/s的流速将待净化的稀释液全部通过免疫脱，收集的洗脱液于50C氮气吹干.用1%乙酸溶液0.5mL溶解残渣，经0.22um的水系微孔滤膜过滤，滤液待检测.
注：使用不同厂商的免疫亲和柱.样品上样、淋洗和洗脱等操作可能略有不同，按说明书要求进行.
5.4仪器参考条件
5.4.1液相色语参考条件如下：
a）色谱柱：C柱（柱长250mm.内径4.6mm，粒径5pm），或等效柱；b）流速：1.0mL/min；c）柱温：30C；d）流动相：色谱纯乙晴-乙酸铵缓冲液（595）； e）进样量：40p;f）检测波长：激发波长385nm，发射波长505nm，
5.4.2柱后衍生参考条件如下：
a）衍生溶液：氢氧化钠溶液（4mol/L）：b）衍生溶液流速：0.5mL/min: e）衍生管温度：110℃.
注：最终流经荧光检测器的氢氧化钠浓度超过1.3mol/1.需选择耐受此氢氧化钠浓度的检测器测定.
5.5标准曲线的制作
标，以相应色诺峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.河原毒素标准溶液的液相色谱图参见附录A中 将标准系列工作液分别注人液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液的浓度为横坐图 A.1.
5.6定性判定
在相同测试条件下，试样溶液与标准溶液中河原毒素的保留时间相比相对偏差在土2.5%以内.
5.7试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谐仅中，测定相应的峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中河豚毒素的浓度.
试样溶液中河豚毒素的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围，或试样溶液中河豚毒素的量接近柱容量时，需要适当减少提取液用量后再净化处理、进样分析.
