中华人民共和国国家标准
GB 5009.300-2025
食品安全国家标准 食品中左旋肉碱的测定
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB29989-2013（食品安全国家标准要幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》.本标准与GB29989-2013相比，主要变化如下：标准名称更改为《食品安全国家标准食品中左旋肉碱的测定》： 一更改了分光光度法：增加了“第二法柱前衍生-高效液相色谱法”；增加了“第三法液相色谱-串联质谱法”.
食品安全国家标准
食品中左旋肉碱的测定
1范围
本标准规定了食品中左旋肉碱的测定方法.
第一法分光光度法适用于婴幼儿食品（不含特殊医学用途婴儿配方食品中的乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方）和乳品中左旋肉碱的测定.
方食品）中左旋肉碱的测定. 第二法柱前衍生-高效液相色谱法适用于食品（不含特殊医学用途婴儿配方食品和特殊医学用途配
第三法液相色谱-串联质谱法适用于婴幼儿配方食品和特殊医学用途配方食品中左旋肉碱的测定.
第一法分光光度法
2原理
试样经过水提取，用高氯酸沉淀蛋白质后过滤，滤液中结合态的左旋肉碱经碱皂化游离出来，与乙酰辅酶A在乙酰肉碱转移酶的催化下反应生成乙酰肉碱和游离的辅酶A.游离的辅酶A和5.5'-二硫 双（2-硝基苯甲酸）反应生成黄色物质，其颜色深浅与游离的辅酶A含量成正比.因游离的辅酶A与左旋肉碱是等摩尔反应关系，可间接求出试样中左旋肉碱的含量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水.
3.1试剂
3.1.1高氯酸（HCIO）.3.1.2氢氧化钠（NaOH）. 3.1.3氢氧化钾（KOH）.3.1.45，5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）（C，HNOS）.3.1.5N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（CHNOS）3.1.6乙二胺四乙酸二钠（CHNNa2HO）.3.1.7乙酰辅酶A（AcetylCoA）：纯度≥85%，在2C~8℃下保存. 3.1.8乙酰肉碱转移酶（CAT）：在2C~8℃下保存.
3.2试剂配制
3.2.1高氯酸溶液（13%）：吸取13mL高氯酸，用水稀释至100mL.3.2.2高氯酸溶液（3%）：吸取3mL高氯酸，用水稀释至100mL.
GB 5009.300-2025
3.2.4氢氧化钾溶液（4mol/L）：称取22.4g氢氧化钾用水溶解，冷却后稀释至100mL.3.2.5显色储备液：分别称取50mg5，5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL水中，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4~7.6，然后3.2.6显色工作液：吸取5mL显色储备液用水稀释至25mL. 用水稀释至50mL.4C保存，有效期3个月.3.2.7乙酰辅酶A（AcetylCoA）溶液：称取20mg乙酰辅酶A溶于2mL水中.临用现配.3.2.8乙酰肉碱转移酶（CAT）溶液：吸取100pL乙酰肉碱转移酶悬浮液，加水至2mL，混匀.临用现配.
3.3标准品
左旋肉碱标准品（CHNO，CAS号：541-15-1）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质.使用前于102℃土2C电热鼓风干燥箱中干燥2h.
3.4标准溶液配制
3.4.1左旋肉碱标准储备液（1mg/mL）：准确称取10mg（精确至0.01mg）左旋肉碱置于10mL烧杯中，加人5mL水溶解，全部转移至10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀.将溶液转移至棕色容器中，4C避光保存，有效期3个月，3.4.2左旋肉碱标准中间液（80pg/mL）：吸取左旋肉碱标准储备液2.00mL，置于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，将溶液转移至棕色容器中，4C避光保存，有效期1个月.3.4.3左旋肉碱系列标准工作液：分别吸取左旋肉碱标准中间液0.125mL、0.50mL、1.00mL、 2.00mL、3.00mL、5.00mL置于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，即得.该系列标准工作液质量浓度分别为 0.4μg/mL、1.6 μg/mL、3.2μg/m1、6.4 μg/mL、9.6μg/mL、16 pμg/mL.临用现配
4仅器和设备
4.1分析天平：感量分别为0.001g和0.01mg.4.2pH计.4.3恒温水浴装置.4.4分光光度计. 4.5电热鼓风干燥箱.
5分析步骤
5.1试样处理
5.1.1固态试样：准确称取5.0g（精确至0.001g）混合均匀的试样于烧杯中，用30mL40℃温水溶解， 转人100mL容量瓶中.加人10mL高氯酸溶液（13%），混合均匀后静置20min.用水定容至刻度，混匀，用定量滤纸过滤.
取滤液20mL，用氢氧化钾溶液（4 mol/L)调节pH至12.5~13.0后，置于40℃水浴中60 min.冷却后先用高氯酸溶液（13%）将pH调至9~10，再用高氯酸溶液（3%）将pH调节至7.0~7.5.将样液转人50mL容量瓶中，用水定容.混匀后置于4C冰箱中静置2h以上.将试样处理液从冰箱中取出放置至室温，取上清液，用0.45pm滤膜过滤后备用.
5.1.2液态试样：准确称取25.0g（精确至0.001g）混合均匀的试样，转人100mL容量瓶中.后续步骤按5.1.1中"加人10mL高氯酸溶液（13%），混合均匀后静置20min"处理.
5.2标准曲线的绘制
酰辅酶A溶液，盖上比色Ⅲ盖，混合均匀后放人分光光度计中，分光光度计的波长调为412nm，5min 吸取左旋肉碱系列标准工作液2.00mL于1cm比色ⅢL中，加人0.80mL显色工作液和100pL乙后归零，迅速加人100uL乙酰肉碱转移酶溶液，混合均匀后放人分光光度计中，反应10min后记录吸光值.以左旋肉碱系列标准工作液的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线.
5.3试样测定
取2.00mL试样处理液按5.2的步骤测定其吸光值.在标准曲线上查得试样待测液的浓度.
6分析结果的表述
试样中左旋肉碱的含量按式（1）计算.
式中：
X 试样中左旋肉碱的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）： 由标准曲线得到的试样溶液中左旋肉碱的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；50 样液的定容体积，单位为毫升（mL）；试样的取样质量，单位为克（g）；V滤液的体积，单位为毫升（mL）； 10换算系数；100样液的定容体积，单位为毫升（mL）.计算结果保留至小数点后2位.
7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%.
8其他
固态试样的方法检出限为0.6mg/100g定量限为2mg/100g-液态试样的方法检出限为0.12 mg/100 g定量限为 0.4 mg/100 g.
第二法柱前衍生-高效液相色谱法
9原理
试样中的左旋肉碱经稀盐酸提取、碱皂化、乙晴沉淀蛋白后，用阳离子交换固相萃取柱净化，净化液中的左旋肉碱在氯甲酸丁酯、三乙胺的催化下与L-丙酰胺-β萘胺发生衍生反应，衍生物用高效液相
