T/SHAAV 标 准
T/SHAAV033-2025
猪萨佩罗病毒核酸与抗体检测技术规程
Technical regulations for porcine sapelovirus nucleic acid and antibodydetection
上海市畜牧兽医学会 发布
目次
前 言1范围2规范性引用文件3术语和定义4荧光定量PCR方法5间接ELISA方法6生物安全要求.附录A（规范性）荧光定量PCR引物序列和反应参数
T/SHAAV 033-2025
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口.
本文件起草单位：上海市农业科学院、上海市浦东新区畜牧水产技术推广中心、上海市金山区动物疫病预防控制中心.
本文件主要起草人：李本强、刘惠莉、陶洁、程靖华、石迎、唐攀、焦嘉杰、康金国、潘旭东.
本文件首批承诺执行单位名单：上海祥欣畜禽有限公司、上海市嘉定区动物疫病预防控制中心、上海市浦东新区畜牧水产技术推广中心、上海市金山区动物疫病预防控制中心、江苏南京诺维赞生物科技 股份有限公司.
猪萨佩罗病毒核酸与抗体检测技术规程
1范围
保存、运输和处理，操作方法，结果判定和生物安全要求. 本文件规定了猪萨佩罗病毒的荧光定量PCR和间接ELISA检测方法的仪器、耗材和试剂，样品采集、
本文件适用于临床样品中猪萨氨罗病毒核酸和抗体的检测.
2规范性引用文件
仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，文件.
GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
猪萨佩罗病毒porcine sapelovirus PSV
小RNA病毒科萨佩罗病毒属，表面无囊膜包被的单股正链RNA病毒.可引起猪腹泻、肺炎、脑脊髓灰质炎、繁殖障碍等多系统综合征，同时也可出现无明显特征的亚临床症状.
3. 2
荧光定量 PCR 方法quantitative real-time polymerase chain reaction qPCR
在PCR扩增反应体系中加入荧光标记物，通过实时监测荧光信号强度，根据模板的Ct值和该模板的起始拷贝数之间的线性关系，进行定量分析的分子生物学方法.
3. 3
间接酶联免疫吸附试验indirect enzyme-linked immunosorbent assay，iELISA
随后加入酶标二抗，孵育后洗去未结合的酶标二抗，加入底物进行显色反应，通过分光光度计进行读数 将抗原结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用待检抗体与抗原特异性结合，孵育后洗去未结合的抗体：分析，OD值的大小与样品中抗体含量成正比.
4荧光定量PCR方法
4.1仪器与耗材
4.1.1全自动组织研磨仪. 4.1.2涡震荡仪.4.1.3荧光定量PCR仪.4.1.5微量移液器（0.5μL~10μL、10μuL~50μL、20 μL~200μL、100μL~1000 μL）和吸头. 4.1.4冰箱（2℃~8℃、-20℃）.4.1.6无菌剪刀.4.1.7镀子. 4.1.8棉拭子.
4.2试剂
除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求.4.2.175%乙醇，无水乙醇和灭菌去离子水配制（符合GB/T6682要求），-20C预冷.4.2.25X反转录混悬液（或反转录酶、Buffer、RNA酶抑制剂、dNTP和随机引物），-20C保存. 4.2.3PBS缓冲液（0.01mol/LPBS pH 7.4），常温保存.4.2.4SYBRGreenPreMix荧光染料预混酶：5U/μuL，-20C保存.4.2.5引物：见附录A.1，-20C保存. 4.2.6阳性对照：含有目的核酸片段的质粒、或含有PSV的阳性样品、或标准毒株，-20C保存.4.2.7阴性对照：PK15细胞悬液或DEPC处理水，-20C保存.
4.3样品采集
4.3.1组织脏器：应采集疑似发病猪的肺和小肠（约1g），用无菌剪刀和镊子剪取待检样品，装入一4.3.2肛拭子：将棉拭子插入猪体肛门并旋转2次~3次，放入装有1mLPBS的样品采集管中，编号 次性塑料袋或其他灭菌容器，编号并填写采样单.并填写采样单.
4.3.3粪便：取猪新鲜粪便（约1g）装入灭菌离心管中，加入1mLPBS，混匀，编号并填写采样单.
4.4样品保存与运输
可放置4C～8C保存，不可超过一周：若采集样品需长期保存，则应放置-20C冻存. 采集的样品放入加了冰袋的保温箱中，尽可能24h内送至实验室检测.若24h不能送至实验室，则
4.5样品处理
4.5.1组织脏器：取1g解冻的组织，剪碎，加入2mLPBS研磨，制备组织匀浆，8000r/min离心5min，取上清用于核酸提取.4.5.2肛拭子：将拭子充分捻动，挤干后弃去拭子：样品管在涡震荡仪上充分振荡1min，3000r/min 离心5min，取上清液用于核酸提取.
4.5.3粪便：样品管在淡涡震荡仪上充分振荡1min，3000r/min离心5min，取上清液用于核酸提取.
4.6样品RNA提取
取经上述处理过的样品上清液，按照柱式法或磁珠法商品化RNA提取试剂盒说明书，提取样品RNA.
4.7反转录
取上述提取的RNA，按照商品化反转录试剂盒说明书进行反转录，制备的cDNA可直接用于荧光定量PCR扩增或-20C冻存备用.
4.8荧光定量PCR检测步骤
4.8.1在试剂配置区进行.设荧光PCR反应管数为n（待检样品数阳性对照阴性对照）. 4.8.2配置荧光定量反应液：10xn μL TB Green Premix Ex TaqIl、0.4xn μL ROX Reference Dye、上游引物（0.4μM）0.8×nμL、下游引物（0.4μM）0.8xnμL、6xnμL灭菌水，混匀.4.8.4每管加入2μLcDNA样品，盖紧管盖后，瞬离混匀. 4.8.3按照每管18μL分装于0.2mL透明PCR管内.4.8.5将PCR管放入荧光定量PCR仪内，进行扩增.4.8.6设定荧光定量PCR反应参数（见附录A.2）
4.9结果判定
4.9.1阈值设定
试验结束后读取检测结果，Ct值的阅值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准.
4.9.2质控标准
