标
准
鱼类无乳链球菌超快速荧光PCR检 测技术规范
Technical Specification for Ultra-fast Real-time PCR Detection ofStreptococcusAgalactiaeinFish
广东省畜牧兽医学会 发布
目次
前言..1范围..2规范性引用文件.3术语和定义.3.1超快速荧光PCR.4缩略语..5试剂和耗材 N5.1试剂..5.2引物和探针 26仪器设备. 27样品采集与处理 N7.1生物安全措施. .27.2样品采集 .27.3样品前处理 .38操作方法8.1DNA提取8.2反应体系的配制.8.3超快荧光PCR反应. 49试验成立条件与结果判定.9.1阔值设定. .49.2试验成立条件9.3结果判定. 5附录A溶液配制附录B无乳链球菌和内参引物、探针的名称、序列附录CDNA提取方法.
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由东莞市动物疫病预防控制中心、广东省畜牧兽医学会提出.
本文件由广东省畜牧兽医学会归口.
主要起草单位：东莞市动物疫病预防控制中心、广东省动物疫病预防控制中心、超快生物技术（广州）有限公司、深圳市动植物疫病预防控制中心、深圳海关动植物检验检疫技术中心、珠海市动物疫病 预防控制中心、广州白云机场海关综合技术服务中心、广州国家实验室、广东省疾病预防控制中心、广州市疾病预防控制中心、广东海大集团股份有限公司、华润五丰肉类食品（河南）有限公司深圳分公司、东莞市洪梅镇农业技术服务中心、东莞市厚街镇农业技术服务中心、东莞市横沥镇农业技术服务中心.
主要起草人：张险朋、林华剑、李敏、管知深、李秋剑、阮周曦、薛晓阳、翁文川、徐强、李柏生、吴新伟、丁文桂、赖笑娴、王桂兰、王婉君、曹蓝、林仰孝、蒋文武、李滴舟、李小军、叶毅飞、 钟群芳、刘雪怡、蔡教英、龙海鹰、邓海燕、莫钻兰、谭铭光、林梦哲.
鱼类无乳链球菌快速荧光PCR检测技术规范
1范围
本文件描述了鱼类无乳链球菌的超快速荧光PCR检测方法.本文件适用于细菌培养物、鱼的苗种、鱼的组织样品、池塘水和环境等样品的无乳链球菌检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7014水生动物检疫实验技术规范SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
一种基于快速温控模块技术（升降温速率40℃/s以上），结合快速启动酶及高特异性预混反应体系所构建的高效核酸扩增检测方法，可在8min~15min内完成45个循环反应.
下列缩略语适合本文件.
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）Ct值：阔值循环数（Cycle threshold）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）R:下游引物（Reverse primer） F:上游引物（Forward primer)P:探针（Probe）BHQ1：黑洞泽灭剂1（Black Hole Quencher 1)FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein） BHQ2：黑洞泽灭剂2（BlackHole Quencher 2）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution）
Cy5：近红外荧光染料（Near-infrared fluorescent dyes 5）
5试剂和耗材
5.1试剂
5.1.1试验用水符合GB/T6682二级水的要求.5.1.2PBS（pH7.2）配制方法按照附录A中A.1，所用试剂为分析纯.5.1.3阳性对照采用无乳链球菌标准菌株，配制方法按照附录A中A.2.5.1.4内参为健康鱼肉组织（不含无乳链球菌）. 5.1.5阴性对照为灭菌生理盐水，配制方法按照附录A中A.3.5.1.65×PCR buffer（含Mg2).5. 1.7 dNTP.5.1.8快速启动聚合酶.5.1.9超快速荧光PCR反应板. 5.1.10DNA提取试剂盒.
5.2引物和探针
超快速荧光PCR扩增（无乳链球菌和内参）引物、探针序列信息见附录B.1.
6仪器设备
6.1超快速荧光PCR仪.6.3生物样品均质器. 6.2移液器（量程：0.5μL~10uL、10uL~100uL、100μL~1000uL）.6.4冷冻高速离心机.6.5ⅡI级生物安全柜.6.6高压灭菌锅. 6.7pH计.
7样品采集与处理
7.1生物安全措施
样品的采集和前处理应避免对病原分析结果有影响的因素发生，防止样品交叉污染.实验室生物安全符合GB19489规定.
7.2样品采集
7.2.1采样工具
镊子、剪刀、1.5mL离心管、2mL组织研磨管、采样瓶等采样器具无菌处理.
7.2.2样品采集
样品包括鱼苗（≤4cm）、鱼组织器官、养殖池塘水、环境拭子和细菌培养物.鱼苗：采样数量、个体要求等应符合SC/T7014的规定.鱼组织器官：无菌操作取绿豆大小的脑、肾脏、肝脏、脾脏等器官组织.细菌培养物：取200uL待检.养殖池塘水：取适量的待检水样于采样瓶中.环境拭子：将拭
