中华人民共和国国家标准
GB 4789.35-2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 乳酸菌检验
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局 发布
前言
SN/T1941.1-2007（进出口食品中乳酸菌检验方法第1部分：分离与计数方法》.
本标准与GB4789.35-2010相比，主要变化如下：一增加了乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明；修改了改良MRS培养基成分：修改了平板计数的接种方法和接种量.
食品安全国家标准
食品微生物学检验乳酸菌检验
1范围
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acidbacteria）的检验方法.本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验.
2术语和定义
2.1
乳酸菌lactic acid bacteria
歧杆菌属（Bifidobacteriaon）和嗜热链球菌属（Streptococcas）. 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称.本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双
3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1恒温培养箱：36C士1℃.3.2冰箱：2℃C~5℃.3.3均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵.3.4天平：感量0.01g. 3.5无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm.3.6无菌吸管：1mL（具o.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头.3.7无菌锥形瓶：500ml.250ml.
4培养基和试剂
4.1生理盐水：见A.1.4.2MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐（CysteineHydrochloride)改良MRS 培养基：见A.2和 A.3.4.3MC培养基（Modified Chalmers 培养基）：见A.4. 4.40.5%蔗糖发酵管：见A.5.4.40.5%纤维二糖发酵管：见A.5.4.60.5%麦芽糖发酵管：见A.5.4.70.5%甘露醇发酵管：见A.5. 4.80.5%水杨苷发酵管：见A.5.4.90.5%山梨醇发酵管：见A.5.4.100.5%乳糖发酵管：见A.5.
4.12革兰氏染色液：见A.7.4.13莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯.
4.11七叶苷发酵管：见A.6.
4.14半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）：纯度>99%.
5检验程序
乳酸菌检验程序见图1.
图1乳酸菌检验程序图
6操作步骤
6.1样品制备
6.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序.6.1.2冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件解冻，时间不超过15min.8 000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1：10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌 6.1.3固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1：10的样品匀液.6.1.4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐
水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1：10的样品匀液.
6.2步骤
6.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐 水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液.
6.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头.
6.2.3乳酸菌计数
6.2.3.1乳酸菌总数
乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表1.
表1乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明
样品中所包括乳酸菌菌属 培养条件的选择及结果说明仅包括双歧杆菌属 按 GB4789.34的规定执行仅包括乳杆菌属 按照6.2.3.4操作.结果即为乳杆菌属总数仅包括嗜热链球菌 1）按照6.2.3.4操作.结果即为乳酸菌总数； 按照6.2.3.3操作.结果即为嗜热链球菌总数网时包括双歧杆菌属和乳杆菌属网时包括双歧杆菌属和嗜热链球菌 1）按照6.2.3.2和6 2.3.3操作，二者结果之和即为乳酸菌总数；2）如需单独计数双歧杆菌属数目，按照6.2.3.2操作网时包括乳杆菌属和嗜热链球菌 2）6 2.3.3结果为嗜热链球菌总数； 1）按照6.2.3.3和6.2.3 4操作，二者结果之和即为乳酸菌总数：3）6 2.3.4结果为乳杆菌属总数同时包括双歧杆菌属，乳杆菌属和嗜热链 1）按照6.2.3.3和6.2.3.4操作，二者结果之和即为乳酸菌总数；球菌 2）如需单独计数双歧杆菌属数目，按照6.2.3.2操作
6.2.3.2双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平Ⅲ内，每个稀释度做两个平Ⅲ.稀释液移人平Ⅲ后，将冷却至48℃的莫匹罗星锂盐培养72h士2h，培养后计数平板上的菌落数，从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成. 和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS培养基倾注入平Ⅲ约15mL，转动平Ⅲ使混合均匀.36℃士1C厌氧
6.2.3.3嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平Ⅲ内，每个稀释度做两个平Ⅲ.稀释液移人平Ⅲ后，将冷却至48C的MC培养基倾注人平Ⅲ约15mL，转动平Ⅲ使混合均匀.36C士1C需氧培养72h士2h，培养后计数.嗜热 链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2mm士1mm，菌落背面为粉红色.从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成.
6.2.3.4乳杆菌计数
根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平Ⅲ内，每个稀释度做两个平Ⅲ.稀释液移人平Ⅲ后，将冷却至48C的MRS琼脂培养基倾 注入平Ⅲ约15mL，转动平Ⅲ使混合均匀.36℃士1C厌氧培养72h士2h.从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成.
