NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T3264-2018
农用微生物菌剂中芽胞杆菌的测定
Determination ofBacillusin agriculturalmicrobialagents
中华人民共和国农业农村部发布
NY/T3264-2018
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口
本标准起草单位：南京农业大学、中国农业大学、中国农业科学院植物保护研究所、江苏省农业科学院植物保护研究所.
本标准主要起草人：高学文、王琦、张杰、陈志谊、伍辉军、吴黎明、顾沁、束长龙、宋福平.
农用微生物菌剂中芽胞杆菌的测定
1范围
本标准规定了农用微生物菌剂中芽胞杆菌的检验方法.
本标准适用于农用微生物菌剂中芽胞杆菌的测定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的. 凡是注日 期的 月文件，仅注日期的版本适用于本文文件
3术语和定义
芽胞杆菌织bacil
业生产，如芽胞杆菌属（Bacillas）、类杆菌（Paen 南门Fim 成员能应 ibacillus 本标准主要包含芽胞杆菌属、类芽胞开菌属和短芽3.1.1
芽胞杆菌属
分类地位：细菌
主要表型特征 生鞭毛，能形成1个内生芽胞.R
3.1.2
类芽胞杆菌属
分类地位：细菌界厚 门芽胞杆南芽胞杆葡目类芽胞杆菌科类 胞杆菌
情况下不产生内生芽胞，但培养 主要表型特征：革兰氏阳性，好氧或核性厌氧，菌体杆状 添加 类如！ 多数能够运动，周生鞭毛，在多数培养 能促进其产生1个内生芽胞.
3.1.3
短芽胞杆菌属Brevibacillus
分类地位：细菌界厚壁菌门芽胞杆菌纲芽胞杆菌目类芽胞杆菌科短芽胞杆菌属.
主要表型特征：革兰氏阳性，大多数好氧，菌体杆状.大多数能够运动，周生毛，能形成1个内生芽胞.
3.2
内生芽胞endospore
内生芽胞是某些细菌如芽胞杆菌在一定的环境条件下，能在菌体细胞内部形成一个圆形或卵圆形休眠细胞.其能帮助细菌渡过逆境.
3.3
脂肽化合物lipopeptide
微生物通过非核糖体途径合成的一类化合物.这类化合物含有亲水的肽链和亲油的脂肪酸经链，从结构上可分为环状脂肽和线性脂肽.在芽胞杆菌中研究较多的是环状脂肽，主要有表面活性素（sur-lactin）、泛革素（fengycin）和杆菌霉素D（bacillomycinD）等.
3.4
伴胞晶体蛋白parasporalcrystalprotein
伴胞品体蛋白是少数芽胞杆菌如苏云金芽胞杆菌，在形成芽胞的同时，会在芽胞旁形成一颗或多颗双锥形、方形或不规则形的蛋白品体.
3.5
菌落形成单位colonyformingunits CFU
在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其计算单位体积中的活菌数量.
4试剂或材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水.
4.1主要溶液
4.1.1革兰氏染色剂：见附录A中的A.1.4.1.2芽胞染色剂，见A.2.4.1.3鞭毛染色剂：见A.34.1.4石炭酸复红染色液：见A.44.1.5澳甲酚紫溶液：见A.5.4.1.6溴麝香草酚蓝溶液：见A.6. 4.1.7对氨基苯磺酸乙酸溶液：见A.7.4.1.8甲蔡胺乙酸溶液：见A.8.4.1.9二苯胺试剂：见A.9.4.1.10二硝基水杨酸试剂：见A.10.
4.2.1酵母粉胰蛋白陈培养基（LB）：见附录B中的B1.4.2.2厌氧培养基：见B2.4.2.3葡萄糖蛋白陈培养基：见B3. 4.2.4蛋白陈水培养基：见B4.4.2.5淀粉水解培养基：见B.5.4.2.6明胶培养基：见B.6.4.2.7柠檬酸盐培养基：见B7.4.2.8丙酸盐培养基：见B.8.4.2.9苯丙氨酸培养基：见B9.4.2.10发酵培养基（Landy）：见B.10.4.2.11产胞培养基（SM）：见B.11.4.2.12无氮培养基（Ashby）：见B12. 2
4.2.13赫奇逊氏培养基（Hutchinson）：见B.13.
5仪器设备
除微生物实验室常规容器、灭菌设备及培养设备外，其他设备如下：
a）PCR仪. b）电泳仪.c）质谱仪.d）酶标仪.e）气相色谱仪，配备氢火焰离子检测器
6试样的制备
6.1抽样
抽样工具，如铲子、匙 生物菌剂剂型的不同，如固体类的粉剂、可 湿性 片剂 本类的 乳剂 干悬浮剂、微乳件.随机抽取3件 剂等.抽样方法按照 -5件 GB 机抽取 以 的产 品，应多抽几 包装箱为一件.大包装产品以 件，随机 装小
6.2样品制备
7 操作步骤
7.1试样的系列稀
称取上述试样 0.0 邮人 加人90ml的无菌水中），静置 液.用无菌移液管 振药摇匀，得到 释度的菌悬1×10²稀释度的菌 液每 个稀释度应更换无菌移液管）. G ER
7.2涂板及计数
分别吸取100gL上述各 梯度移路液于LB平板上，并用主形玻璃棒 购匀涂布在整个平板表面，每1 得到样品中芽胞杆菌稀释度做3次重复然后置于 的菌量. C~37t 培养24h~
7.3确证试验
7.3.1菌种制备
自上述涂布计数中挑取5个特征的单菌落，画线接种于LB平板上，37C培养48h左右.之后从每一画线LB平板中选取至少1个良好分离的特征单菌落，转接保存，进行确证试验.
7.3.2形态观察
观察纯化菌落的形态特征，包括菌体颜色、表面和边缘特征、菌落的黏稠性等；挑选纯化的菌落做革兰氏染色（4.1.1）、芽胞染色检测（4.1.2）和毛染色（4.1.3）.
7.3.3生理生化确证试验
挑选纯化的菌落进行厌氧生长反应（4.2.2）、V-P反应（4.2.3）、产酸实验（4.2.4）、淀粉水解实验（4.2.5）、明胶水解实验（4.2.6）、柠檬酸盐利用（4.2.7）、丙酸盐利用（4.2.8）、苯丙氨酸脱氨（4.2.9）、卵
