中华人民共和国农业行业标准
NY/T3287-2018
日本看麦娘对乙酰辅酶A化酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程
Guideline forthe detectionofAlopecurusjaponicusSteud.target-siteresistance toacetolactate synthaseinhibitingherbicides
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由中华人民共和国农业农村部提出并归口.本标准起草单位：中国农业科学院植物保护研究所.本标准主要起草人：崔海兰、李香菊、黄兆峰、王京京、于惠林、魏守辉.
日本看麦娘对乙酰辅酶A羚化酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程
1范围
本标准规定了日本看麦娘（Alopecurujapopicus Steud）对乙酰辅酶A双化酶（acetyl-coenzymeAcarboxylase，ACCase）抑制剂类险草剂靶标抗性检测技术规程的检测程序、结果分析及注意事项.
2规范性引用文件
的版本适用于本文件.凡是不注日期的 下列文件对于本文件的 用 日期
NY/T 1667 农药NY/T1859 险评估 完性 风险评估
通过整株杂草生 量的关系，以杂草地上部生物量受除草剂 性的方法
除草剂对杂草疑似抗药性种群与敏感种群的生长抑制中量的比值.
3.6
靶标基因突变target-sitegenemutation
由于靶标基因DNA分子中碱基对的取代，导致mRNA的某一密码子发生变化，从面引起编码的氨基酸变成另一种氨基酸，最终导致靶标酶多肽链中的氨基酸序列发生改变.
4检测程序
4.1种子采集
当日本看麦娘种子成熟时，在疑似发生抗药性的田块采集种子.采样田块应具有代表性，面积不小于667m，成熟种子量不少于2000粒.
及时晾干采集的种子，装人种子保存罐，置于阴凉干燥处保存.
4.2材料培养
直径不小于10cm的培养钵：待测种群及敏感对照种子分别定量均匀撒播在土壤表面，覆土约1cm，采 选择无日本看麦娘种子、无除草剂残留的农田地表土，混合20%～30%的草炭土，混合均匀后装人用盆体底部渗灌方式补充水分：置于15℃~25℃，光照时间8h~10h条件下培养.待日本看麦娘长至2叶期，间苗，每盆保留长势一致的10个植株
4.3生物测定
4.3.1单剂量甄别法
待植株长至3叶期，用待测除草剂（ACCase抑制剂类除草剂）进行茎叶喷雾处理，除草剂剂量采用敏感种群的最低致死剂量，每个处理不少于4次重复，每个重复30株.用药21d后，调查存活株数，按式（1）计算株防效（%）.
式中：
E一-存活植株数占总处理植株数的百分比，单位为百分率（%）；
NL一处理后存活植株数，单位为株；
NT--处理植株总数，单位为株.
4.3.2剂量反应曲线法
经单剂量甄别法检测而明确有抗性的植株，进行繁殖，获得的种子用剂量反应曲线法进一步检测抗药性指数.
待植株长至3叶期，用待测除草剂（ACCasc抑制剂类除草剂）进行茎叶喷雾处理，药剂处理至少设置5个剂量，每个剂量不少于4次重复，每个重复10株，以杂草鲜重或干重为指标，建立剂量反应方程，按式（2）计算生长抑制中量.
（2）
式中：
Y 在除草剂处理下杂草地上部分鲜重或干重与对照鲜重或干重的百分比，单位为百分率 （%);C 待测指标下限，单位为百分率（%）；D 待测指标上限，单位为百分率（%）；X 除草剂剂量，单位为克每公顷（g/hm²）；GR 斜率. 生长抑制中量，单位为克每公顷（g/hm²）；按式（3）计算抗药性指数R1.
式中：
RI 抗药性指数：GRR 抗药性种群生长抑制中量，单位为克每公顷（g/hm²）；
GRss敏感性种群生长抑制中量，单位为克每公顷（g/hm²）
4.4靶标基因检测
4.4.1DNA提取
取杂草幼嫩叶片，约200mg，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法或商品化试剂盒提取总DNA.每个抗药性种群随机检测10个~20个抗药性植株.
用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量是否合格，电泳出现一条清晰明亮的条带，表示DNA较完整，无降解.
DNA样品的纯度及浓度检测：用分光光度计测定DNA溶液在260nm处的吸光值（OD）.OD值等于1时，样品中DNA浓度为50μg/mL.按式（4）计算DNA浓度，
CNAODXAX50
式中：
CDNADNA浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；
ODDNA溶液在260nm处的吸光值；
A稀释倍数.
通过测定DNA溶液在260nm和280nm处的吸光值（OD和OD）检测DNA纯度，OD/OD值在1.7~2.0之间，表明DNA的纯度较好.
经过电泳和吸光度检测，质量和纯度符合要求的DNA样品可用于后续检测.
4.4.2聚合酶链式反应（PCR）
日本看麦娘有2个ACCase，用2对引物扩增靶标基因，引物对1为：5'-GCAAACTCNGGT-GCTCGGATTGGCA-3'和5'-GAACATANCTGAGCCACCTCAATATATT-3'，扩增片段大小为553bp：引物对2为：5'-TGCATACAGCGTATTGACCAG-3’和5'-CTCTGACCTGAACTT-GATCTC-3'，扩增片段大小为873bp.
0.5gL，5U/L的TaqDNA聚合酶0.5L，提取的待测DNA样品1gL.加人18L无菌蒸馏水至反 PCR反应体系：2.5 mmol/L的dNTP混合液2L 10×PCR Buffer 2.5μL，10μmol/L的引l物各应体系为25uL.PCR反应条件：95C加热5min，使DNA裂解变性；进人反应循环，在每一个循环中，95C裂解30s，在各引物对相应的退火温度下反应30s，72℃延伸0.5min，共30个循环；最后72C继续延伸5min，使产物延伸完整.2对引物的退火温度均为60℃.
无杂带，判断产物浓度和扩增特异性. PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断产物片段大小与预期是否相符，根据条带亮度和有
4.4.3PCR产物测序
PCR产物的电泳检测结果符合预期时，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对产物进行回收纯化，纯化后的PCR产物送测序公司测序，测序引物分别为上述引物对.
5结果分析
5.1单剂量甄别结果分析
喷施最低致死剂量的除草剂21d后调查株防效，敏感对照全部死亡，说明检测结果有效.如果待测种群有存活植株，说明产生抗性，通过调查株防效可以初步了解该采样点是否产生抗性及抗性比例.
5.2剂量反应曲线结果分析
根据RI值判断抗药性水平高低.
5.3靶标基因检测结果分析
测序峰图序列与大穗看麦娘（Alopecwurus myosuroidesHuds.）（GenBank上的登记号为AJ310767）和日本看麦娘（GenBank上的登记号为KJ781292和KJ781293）的ACCase序列进行比对，分析靶标基因突变的位点.
目前在抗ACCasc抑制剂类除草剂的杂草中发现有7个位点氨基酸被取代与抗性相关，分别是
