附件5
水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201705）
1范围
本方法规定了水产品中硝基呋哺类代谢物快速检测方法.
本方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中呋嘲唑酮代谢物（AOZ）、呋嘀它酮代谢物（AMOZ）、呋嘲西林代谢物（SEM）、呋哺妥因代谢物（AHD）的快速测定.
2原理
样品中硝基呋响类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（T线）上硝基呋哺类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅的变化.通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中硝基呋嘀类代谢物进行定性判定.
3试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水.
3.1试剂
3.1.1盐酸.3.1.2三水合磷酸氢二钾.3.1.3氢氧化钠.3.1.4甲醇.3.1.5乙醇.3.1.6乙腊.3.1.7邻硝基苯甲醛.3.1.8三羟甲基氨基甲烷.3.1.9乙酸乙酯.3.1.10正已烷.定容至100mlL3.1.12磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：准确称取22.822g三水合磷酸氢二钾（3.1.2），用水溶解并定容至1000mL.
3.1.13氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称39.996g氢氧化钠（3.1.3），用水溶解并稀释至1000mL.3.1.14盐酸溶液（1mol/L）：取10mL盐酸（3.1.1）加入到110mL水中.3.1.15三羟甲基氨基甲烷溶液（10mmol/L）：准确称取1.21lg三羟甲基氨基甲烷（3.1.8），溶于80mL水中，加入盐酸（约42mL）调pH至8.0后用水定容至1L.
3.2参考物质
3.2.1硝基呋嘀类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%.
表1硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
中文名称 英文名称CAS登录号 分子式 相对分子量3-氨基-2-恶唑烷酮 3-anmino-2-oxazoli dinone AOZ 6-59-08 CHNO 102.095-morpholine-meth5-甲基吗啉-3-氨基 yl-3-amino-2-oxazo 43056-63-9 CHsN O 201.22-2-唑烷基酮 lidinone AMOZ1-氨基-2-乙内酰脲 1-Aminohydantoinh盐酸盐 ydrochloride AHD 2827-56-7 C H N OHC1 151.55semicarbazidhydroc氨基脲盐酸盐 hloride SEM 563-41-7 NHCONHNH-HC1 111.53
注：或等同可溯源物质.
3.3标准溶液的配制
3.3.1标准储备液：分别准确称取适量参考物质（精确至0.0001g），用乙晴溶解，配制成100mg/L的标准储备液.-20C冷冻避光保存，有效期12个月.
3.3.2混合中间标准溶液：准确移取标准储备液（3.3.1）各1mL于100mL容量瓶中，用乙定容至刻度，配制成浓度为1mg/L的混合中间标准溶液.4C冷藏避光保存，有效期3个月.
3.3.3混合标准工作溶液：准确移取0.1mL混合中间标准溶液（3.3.2）于10mL容量瓶中，用乙定容至刻度，配制成浓度为0.0lmg/L的混合标准工作溶液.4C冷藏避光保存，有效期1个月.
3.4材料
3.4.1AOZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）.3.4.2AMOZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）.3.4.3SEM试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）.3.4.5固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格1mL，填装量为60mg. 3.4.4AHD试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）.
4仪器和设备
4.1电子天平：感量分别为0.1g和0.0001g.4.2均质器.4.3水浴箱.4.4离心机.4.5氮吹仪或空气吹干仪.4.6移液枪：10μL 100μL，1000uL，5000uL.4.8胶体金读数仪（可选）.4.9固相萃取装置（可选）.4.10环境条件：温度15-35℃，湿度≤80%.
4.7涡旋振荡仪.
5分析步骤
5.1试样制备
用于后续实验. 按照方法要求，称取一定量具有代表性样品可食部分（注：甲壳类，试样制备时须去除头部），
5.2试样提取和净化
称取适量的匀浆样品（以试剂盒操作说明书要求来定，精确至0.01g）于50mL离心管.
称取2g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mL1mol/L盐酸（3.1.14）和0.2mL10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11），充分振荡3min：将上述离心管在60℃水浴下孵育60min：依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（3.1.12），0.4mL1mol/L氢氧化钠溶液（3.1.13），乙酸乙酯6mL，充分混合3min，在室温（20-25℃）下4000r/min，离心5min：移取离心后的上层液体3mL于5mL离心管中，60℃下氮气空气吹干：向吹干的离心管中加入2mL 正已烷，振荡1min，然后加入0.5mL10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15），充分混匀30s，室温下4000r/min，离心3min（或静置至明显分层）：下层溶液即为待测液.
5.2.2方法二（固相萃取法）
称取6g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mL1mol/L盐酸水浴下孵育60min：依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（3.1.12），0.4mL1mol/L氢氧化钠溶 （3.1.14）和0.2mL10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11），充分振荡3min：将上述离心管在60℃液（3.1.13），乙酸乙酯6mL，充分混合3min，在室温（20-25℃）下4000r/min，离心5min：移取离心后的上层液体3mL于15mL离心管中，加入10mL10%乙酸乙酯-乙醇溶液，上下颠倒混合4-5次，4000r/min离心1min（底部会有部分沉淀）连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱（3.4.5）控制液体流速约1滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱，再重复推压注射器活塞2次， 上方连接30mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除干净.将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再
向固相萃取柱中加1mL10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15）.用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中后，离心管中的液体即为待测液.
5.3测定步骤
5.3.1试纸条与金标微孔测定步骤
吸取适量样品待测液于金标微孔中，抽吸5-10次混合均匀，室温（20-25℃）温育5min，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育3一6min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定.
5.3.2检测卡测定步骤
吸取适量样品待测液于检测卡的样品槽中，室温（20一25C）温育5-10min，直接进行结果判定.
5.4质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验.
5.4.1空白试验
称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作.
5.4.2加标质控试验
物标准工作液，使其浓度为0.5ug/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作. 准确称取空白样品适量（精确至0.0lg）置于50mL具塞离心管中，加入适量硝基呋喃类代谢
6结果判定要求
说明书.采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图如图1和图2所示. 结果的判断也可使用胶体金读数仪判读，读数仪的具体操作与判读原则请参照读数仪的使用
6.1比色法
6.1.1无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效.
6.1.2阳性结果
响类代谢物高于方法检测限，判为阳性. 检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中硝基呋
6.1.3阴性结果
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中硝基呋响类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性.
图1目视判定示意图（比色法）
6.2消线法
6.2.1无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效.
6.2.2阳性结果
检测线（T线）不显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性.
6.2.3阴性结果
检测线（T线）与控制线（C线）均显色，表明样品中硝基呋哺类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性.
图2目视判定示意图（消线法）
6.3质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性.
7结论
当检测结果为阳性时，应对结果进行确证.
8性能指标
