附件4
食品中亚硝酸盐的快速检测 盐酸萘乙二胺法（KJ201704）
1范围
本方法规定了食品中亚硝酸盐的快速检测方法.
本方法适用于肉及肉制品（餐饮食品）中亚硝酸盐的快速测定.
2原理
样品中的亚硝酸盐经提取后，在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺反应生成紫红色偶氮化合物，其颜色的深浅在一定范围内与亚硝酸盐含量成正相关，通过色阶卡进行目视比色，对样品中亚硝酸盐进行定性判定.
3试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水.
3.1试剂
3.1.1对氨基苯磺酸.3.1.3盐酸.3.1.4盐酸（20%）：量取20mL盐酸，用水稀释至100mL.3.1.5对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%盐酸中，混匀，置棕色瓶中，临用新制.3.1.6盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）：称取0.2g盐酸茶乙二胺，溶解于100mL水中，混匀，置棕色瓶中，临用新制.
3.1.2盐酸萘乙二胺.
3.2参考物质
亚硝酸钠参考物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥99%.
表1亚硝酸钠中文名称、英文名称、CAS登记号、分子式、相对分子质量
中文名称英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子质量亚硝酸钠 Sodiumnitrite 0-00-29 NaNO 00°69
3.3标准溶液配制
亚硝酸钠标准工作液（200pg/mL，以亚硝酸钠计）：精密称取适量经110℃-120℃干燥恒重的亚硝酸钠参考物质（3.2），加水溶解，移入250mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀.
3.4材料
亚硝酸盐快速检测试剂盒：适用基质为肉及肉制品，需在阴凉、干燥、避光条件下保存.
4仪器和设备
4.1移液器：200uL，1mL.4.2涡旋混合器或超声仪.4.4离心机.4.5微孔滤膜：0.45um（水系）.
4.3电子天平或手持式天平：感量为0.01g和0.0001g.
5分析步骤
5.1试样制备
取适量有代表性样品的可食部分，充分粉碎混匀.
5.2试样的提取
准确称取试样1g（精确至0.01g），置于离心管中，准确加水10mL，超声或涡旋振荡提取5min，静置10min.准确吸取1mL上清液（如样品浑浊，≥3000r/min离心5min取上清液，或经微孔滤膜过滤后取续滤液）于检测管中，向检测管中滴加对氨基苯磺酸溶液200uL，混匀静置1min，再加 入盐酸萘乙二胺溶液100uL，混匀静置5min，即得待测液.
5.3测定步骤
将待测液与标准色阶卡目视比色，10min内判读结果.进行平行试验，两次测定结果应一致，即显色结果无肉眼可辨识差异.
5.4质控试验
每批样品应同时进行空白试验和质控样品试验（或加标质控试验）.用色阶卡和质控试验同时对检测结果进行控制.
5.4.1空白试验
称取空白样品，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作.
5.4.2质控样品试验（或加标质控试验）
量亚硝酸盐，并可稳定保存的样品.经参比方法确认的质控样品中亚硝酸盐含量（以亚硝酸钠计） 亚硝酸盐质控样品：采用典型样品基质或相似样品基质按照实际生产工艺生产的，含有一定应包括但不限于10mg/kg
加标质控样品：准确称取空白试样1g（精确至0.0lg），置于离心管中，加入适量亚硝酸钠标准工作液（200ug/mL）（3.3）使样品中亚硝酸钠含量为10mg/kg.
质控样品（或加标质控样品）按5.2和5.3步骤与样品同法操作.
6结果判定要求
观察检测管中样液颜色，与标准色阶卡比较判读样品中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量.额色浅于检出限（1mg/kg）则为阴性样品：颜色深于10mg/kg则为阳性样品.色阶卡见图1.
注：1.颜色接近或深于1mg/kg，但浅于或接近10mg/kg时，则考虑本底污染或带入所
2.10mg/kg仅作为本方法的本底控制限.
图1亚硝酸盐色阶卡
围内，加标质控试验测定结果应与加标量相符. 质控试验要求：空白试验测定结果应为阴性，质控样品试验测定结果应在其标示量值允差范
7结论
由于色阶卡目视判读存在一定误差，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不就低的原则.当测定结果大于10mg/kg时，应对结果进行确证.
8性能指标
8.2灵敏度：灵敏度应≥99%8.3特异性：特异性应≥85%.8.4假阴性率：假阴性率应≤1%.
8.1检测限：1mg/kg.
8.5假阳性率：假阳性率应≤15%.
注：性能指标计算方法见附录A
9其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不作限定.方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标.
二法分光光度法》. 本方法参比方法为GB5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定一第
待测样品中若存在高含量的亚硫酸氢钠、抗坏血酸或酱油时，会对本法的显色结果产生一定影响，检测时应予以注意.
色阶卡应确保在试剂盒保质期内不出现褪色或变色的情况.
附录A
快速检测方法性能指标计算表
表A.1性能指标计算表
样品情况“ 检测结果 总数阳性 阳性 N 阴性 N2 N=NN2阴性 N N N=NN总数 N=NN2 N=N2N2 N=N1.N或 N.N.2显著性差异（x) x2=(N-N|-1)²/(NN2) 自由度（df）=1特异性（p-.%） 灵敏度（p，%） p=N11/N1. p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf，%) pf=N21/N2.=100-特异性相对准确度，% (NN22)/(NN)注：由待确认方法检验得到的结果.灵敏度的计算使用确认后的结果，用于确认方法时，结果 由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果：≥1mg/kg时，判定为阳性（仅用于计算性能指标）：“本方法规定：用于计算灵敏度和假阴性率的阳性样品，由参比方法检验得到的结果范围应在1-10mg/kg之间.N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列.例如：N11表示第一行， 第一列，N1.表示的第一行，N.2表示的第二列：N12表示第一行，第二列.“为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价.
本方法负责起草单位：陕西省食品药品监督检验研究院验证单位：四川省食品药品检验检测院、山西省食品药品检验所主要起草人：刘海静、李涛、林芳、王一欣、袁磊
