附件
蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、 敌敌畏残留的快速检测（KJ201710）
1范围
本方法规定了蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测方法.
本方法适用于油菜、菠菜、芹菜、韭菜等蔬菜中敌百虫、丙澳磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速测定.
酶抑制（率）法（分光光度法）
2原理
在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关.正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率.
3试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水.
3.1试剂
3.1.2磷酸氢二钾（KHPO4）. 3.1.3磷酸二氢钾（KHPO4）.3.1.45.5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（CHNOgS）.3.1.5碳酸氢钠（NaHCO）.3.1.6碘化乙酰硫代胆碱（CHgINOS）.3.1.7pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9g无水磷酸氢二钾及3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000mL水中，混匀.3.1.8显色剂：分别取160mg5.5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用3.1.9底物：取125mg碘化乙酰硫代胆碱，加15mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4C冰箱中保存 20mL缓冲溶液溶解，4C冰箱中保存.备用.保存期不超过两周.3.1.10乙酰胆碱酯酶：4C冰箱中保存备用.
3.1.1丙酮（CHCOCHs）.
3.2参考物质
3种有机磷和2种氨基甲酸酯类农药参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥98%.
表1有机磷和氨基甲酸酯类参考物质中文名称、英文名称、
CAS登录号、分子式、相对分子质量
序号 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子质量1 克百威 Carbofuran 1563-66-2 CHNO 221.252 灭多威 Methomyl 59669-26-0 CsHNOS 162.233 丙溴磷 profenofos 41198-08-7 CHsBrCIO PS 373.634 敌敌畏 Dichlorvos 62-73-7 CH C1O P 220.985 敌百虫 Dipterex 52-68-6 CHCI;OP 257.44
3.3标准溶液的配制
3.3.1 克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准储备液（1000μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存.
3.3.2丙溴磷标准储备液（100μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存.
3.3.3克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准中间液A（100μg/mL）：精密移取上述标准储备液（1000μg/mL）（3.3.1）各1mL，分别置于10mL容量瓶中，用丙酮（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/mL的标准液A.
3.3.4克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫、丙澳磷标准中间液B（1μg/mL）：精密移取标准中间液A（100μg/mL）（3.3.3）及丙溴磷标准储备液（100μg/mL）（3.3.2）各1mL，分别置于100mL容量瓶中，用缓冲溶液（3.1.7）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的标准中间液B.
4仪器和设备
4.1恒温水浴锅.4.2天平：感量为0.1g4.3分光光度计或相应商品化测定仪.4.4环境条件：温度15°℃~35℃，湿度≤80%.
5分析步骤
5.1试样的提取
5.1.1整株提取法
选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3g（精确至0.1g）置于表面Ⅲ中，加入10mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2min以上，取上清液
备用.
5.1.2整体测定法
选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取3g（精确至0.1g）放入离心管中，加入10mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50次，静置2min以上，倒出提取液，静置3min~5min，待用.
5.2测定步骤
5.2.1对照液的测定
先于反应管中加入3mL缓冲溶液（3.1.7），再加入适量酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37C水浴锅中放置15min.加入0.1mL底物摇匀，立即测定吸光度，3min后再测定一次，记录反应3min的吸光度值的变化AAa.
5.2.2样品液的测定
先于反应管中加入3mL提取液，其他操作与对照液操作（5.2.1）相同，记录反应3min的吸光度值的变化AA
5.3质控试验
每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验.
5.3.1空白试验
称取空白试样，按照5.1和5.2步骤与样品同法操作.
5.3.2加标质控试验
5.3.2.1韭菜、芹菜加标实验
取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3g（精确至0.1g）置于表面Ⅲ中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液B（1μg/mL）（3.3.4），加入10mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2min以上，取上清液备用.
其余操作按照5.2步骤同法操作.
5.3.2.2油菜、菠菜加标实验
取空白试样，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取5份试样各3g（精确至0.1g）放入小离心管中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液B（1μg/mL）（3.3.4），加入10mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50次，静置2min以上，倒出提取液，静置3min~5min，待 用.
其余操作按照5.2步骤同法操作.
6结果的表述
6.1结果计算
抑制率（%）=[（△A△A）/△A]×100
式中：
AAs对照溶液反应3min吸光度的变化值：
AA样品溶液反应3min吸光度的变化值：
6.2结果判定
结果以酵被抑制的程度（抑制率）表示.
6.3质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性.
7结论
当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量.
8性能指标
8.1检测限：敌百虫0.1mg/kg，丙澳磷0.5mg/kg，灭多威0.2mg/kg，克百威0.02mg/kg，敌敌畏0.2 mg/kg
8.2灵敏度：灵敏度应≥95%
8.3特异性：特异性应≥85%.
8.4假阴性率：假阴性率应≤5%.
8.5假阳性率：假阳性率应≤15%.
注：1.性能指标计算方法见附录A.
2.吸光度变化AA值应控制在0.2一0.3之间.具体的酶量，应根据产品说明书上标识的使用量，测定AA值.根据测定值，增加或减少酶量，使AA值控制在0.2~0.3之间.
检测卡法
9原理
样品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留经缓冲液提取，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶（白色药片）有抑制作用，抑制胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸与靛酚（蓝色），从而导致速测卡颜色深浅的变化.通过空白颜色比较，对样品中有机磷和氨基甲酸酯类农 药进行定性判定.
10试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水.
10.1试剂
10.1.1丙酮（CHCOCH）.10.1.2磷酸氢二钾（KHPO）.
10.1.3磷酸二氢钾（KHPO）.
10.1.4pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9g无水磷酸氢二钾及3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000mL水中，混匀.
10.2参考物质
同3.2.
10.3标准溶液的配制
同3.3.
10.4固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（检测卡）.
11仪器和设备
11.1恒温水浴锅.
11.2天平：感量为0.1g
11.3环境条件：温度15C~35°℃，湿度≤80%.
12分析步骤
12.1试样的提取
12.1.1整株提取法
选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3g（精确至0.1g）置于表面Ⅲ中，加入10mL缓冲液（10.1.4），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2min以上.
12.1.2整体测定法
0.1g）放入小离心管中，加入10mL缓冲溶液（10.1.4），振摇50次，静置2min以上. 选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取3g（精确至
12.2测定步骤
吸取2滴左右待测液于白色药片反应区域，在37C恒温装置中放置15min进行预反应，预反应后的药片表面必须保持湿润.
将速测卡对折，手捏3min或置于37C恒温装置3min，保证红色药片反应区域与白色药片反应区域完全叠合发生反应.
每次测定需有一个缓冲溶液的空白对照.
12.3质控试验
每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验.
12.3.1空白试验
称取空白试样，按照12.1和12.2步骤与样品同法操作.
12.3.2加标质控试验
