中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T0168-2015代替SN 0168-1992
进出口食品中菌落总数计数方法
The aerobic plate counts in foods for import and export
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准主要参考美国食品和药物管理局（FDA）（细菌学分析手册）第八版第三章（2001年）.本标准代替SN0168-1992（出口食品平板菌落计数）.本标准与SN0168-1992相比，主要变化如下： 一将原标准名称《出口食品平板菌落计数》修订为《进出口食品菌落总数计数方法》，英文名称也做了相应的修改：-5.1中的样品制备程序对原标准有所改动； 定义”"数字修约和计算”等标准编写要素及相关内容；一APC的计算方法和计算公式做了修改.本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局. 本标准主要起草人：苗丽、马艳艳、张子宏、李柯、杨娜、卢兴安、雷质文、李志培.本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
SN .
进出口食品中菌落总数计数方法
1范围
本标准规定了进出口食品中需氧菌及兼性厌氧菌的菌落总数计数方法.标准. 本标准适用于各种进出口食品及其原料，有专门规定检验方法的除外，其他产品可参考使用本
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2.1
菌落总数aerobic plate counts;APC
食品检样经过处理，在一定条件（如合适的培养基、温度、时间等）下培养后，所得1mL（或1g）检样中温需氧菌的菌落总数.
注：菌落总数是指产品中需氧微生物含量的高低，是衡量产品受污染程度的一项重要指标.
2.2
估计值estimation of aerobic plate counts:EAPC
平板菌落计数的估计值.
菌落形成单位colony-formingunits；CFU
一个细菌在平板计数琼脂培养基上生长形成肉眼可见的菌落.
2.4多不可计toonumerous to count：TNTC
平板上的菌落数太多面无法计数.
2.5实验室事故laboratory accident；LA实验过程污染等导致结果无效的情况.
3环境、设备和材料
3.1环境要求：实验室环境要求干净、光照充足、通风良好，工作台要平稳且台面面积足够大，需定期对工作区域内空气中的微生物密度进行监测，可将倾注有琼脂的平Ⅲ在空气中暴露15min后放培养箱3.2均质器和均质袋或均质杯. （36℃土1C）中进行培养，48h后每个平Ⅲ上的菌落不能超过15个.3.3天平：感量0.1g.3.4剪刀、镊子、刀子、叉子或大汤勺：各实验室可根据自己的爱好选择，方便取样即可.3.5玻璃平Ⅲ或塑料平Ⅲl：建议使用15mm×90mm的平Ⅲ.3.6灭菌吸管或移液器：量程分别为1mL5mL和10mL，刻度为0.1mL.
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3.7带橡胶塞或塑料螺旋帽的玻璃稀释瓶：容量200mL.3.8恒温水浴箱：45C士1℃，用来融化凝固的琼脂用.3.9恒温培养箱：36℃±1℃C.3.10冰箱：0℃C~5℃C.3.11冰柜：-20℃~-15℃. 3.12合适温度范围的温度计（已计量）.
4培养基、试剂
4.1平板计数琼脂（参见附录A.1）. 4.2磷酸盐缓冲稀释液（参见附录A.2）.4.3无菌生理盐水（参见附录A.3）.4.41mol/L氢氧化钠（NaOH）：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中.
5程序
5.1样品制备
以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内.如有包装，则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样.
5.2制备样品匀液
5.2.1固体或半固体样品：以无菌操作，取25g或25mL样品（根据样品分布的均匀性程度，也可的情增减样品量，如50g或50mL等），放人装有225mL稀释剂（磷酸盐缓冲稀释液或无菌生理盐水，以下同）的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1min~2min，或放人盛有225mL稀释剂的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1：10的样品匀液.如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却.
5.2.2干燥或干粉食品：以无菌操作取25g样品，放人装有225mL稀释剂和适量玻璃珠的500mL稀 释瓶中.迅速振摇，将样品混匀，制成1：10的样品匀液.报摇时，幅度为30cm，7s内振摇25次，也可用机械振荡器振荡15s代替手摇.
5.2.3液体样品：用灭菌吸管吸取25mL样品，放人装有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，按5.2.2液体要在2s~4s内完全排人稀释剂中.不要在稀释剂中吹洗吸管. 中所述方法迅速振摇，制成1：10的样品匀液.吸取样品时，吸管插人液面下不要超过2.5cm，吸管内
5.3稀释样品均液
5.3.1取此样品匀液1mL加到9mL的稀释剂中，并以此类推，分别制成10，10，10三个连续稀释度或其他合适稀释度的样品匀液，每个稀释度换用一个新的无菌吸管.5.3.2样品匀液都要在7s内沿直径30cm的弧线摇动25次，摇动时要避免产生泡沫.
5.4平板接种
5.4.1每个稀释度的样品匀液各取1mL注人一个平Ⅲ，一式两份，平Ⅲ预先要做适当的标记.如果样品匀液在吸取前静置时间超过了3min，要按上述方法再次摇动.5.4.2在原始样品稀释液制备后的15min内，每个平Ⅲ中注人12mL~15mL平板计数琼脂（预先已
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放于45℃士1℃的水浴中恒温），即每个样品从开始稀释到倾注最后一个平Ⅲ所用的时间不得超过15min.每个稀释度的样品分别制两个琼脂平板.
5.5培养
平板. 待琼脂凝固后，翻转平Ⅲ，放入培养箱36C士1C培养48h土2h.注意在琼脂凝固前不要叠放
6菌落计数和记录
6.1培养后，立即计数每个平板上的菌落数，如果不能立即计数，平板存放温度应为0℃～4℃，但不 得超过24 h.
6.2对成对的平板都要计数，并将计数的结果按下面规定的方法计算后报告.25个～250个菌落为正常计数范围，超出25个～250个菌落范围的计数结果可能不是实际菌落数的真实反映.因为菌落数过少的平板（少于25个），稀释因素可能会夸大计数结果；而菌落数过多的平板（超过250个），一方 面因为难以计数，另一方面因为会抑制某些细菌的生长，可能会导致计数结果低于实际菌落数.报告
6.3菌落数在25个～250个正常范围值的平板：选择无蔓延菌落的平板，计数菌落形成单位（CFU），包括那些极微小的菌落.记录下计数的每个平板的菌落数和稀释倍数.
6.4超过250个菌落的平板：稀释度的平板上的菌落数都超过250个时，对于接近250个菌落的 平板，先划出分布有代表性的区域进行计数，再计算出整块板的菌落数，用EAPC来报告计算出的需氧菌数，以表明该数值是从菌落数在25个～250个范围之外的平板得出的估计值.其余平板都记录为“多不可计"（TNTC）.
6.5无菌落生长的平板.如果稀释度的平板都没有菌落生长，则APC报告为小于1乘以样品的 最低稀释倍数，报告时将计算出的APC值标上星号，以表明该数值是从菌落数在25个～250个范围之外的平板得出的估计值.
6.6蔓延菌落通常有3种类型.第一种类型是链状菌落，菌落之间没有明显界限，一般由一个细菌形成：第二种类型是在琼脂和平Ⅲ底部之间生长形成的水膜样菌落；第三种类型是在琼脂的边缘或表面形成的水膜样菌落.
如果平板上生长的蔓延菌落过多而出现下述两种情况：
a）蔓延菌落覆盖的面积，包括由于蔓延菌落造成的抑制生长区的面积超过平板面积的50%；
b）由于蔓延菌落造成的抑制生长的面积超过平板面积的25%.
这样的平板不予计数，结果报告为”蔓延菌落”
当有必要计数除以上a)和b)两种情况以外的蔓延生长菌落时，将三种不同类型的蔓延菌落分别计数，对于第一种类型，如果仅有一条链，将整条链作为一个菌落计数，如果有来源不同的几条链，将每一条链作为一个菌落计数，不要把链上生长的各个菌落分开来计数.第二种和第三种类型的蔓延菌落一般都容易识别，也按上述方法计数，最后将计数的蔓延菌落数和正常菌落数加在一起，计算出平板的总需氧菌数（APC）.
6.7如果已知平板被污染或有其他方面不满意的因素，把该结果记录为实验室事故（LA）.
7数字修约和计算
7.1数字修约
7.1.1计算APC时为了避免结果在精密度和准确度方面产生误差，结果只报告前两位有效数字.当
