中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第17部分：荞麦
Food allergen detection with LAMP methods for exportPart 17:Buckwheat
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成：
第1部分：开心果：第2部分：腰果； 第3部分：胡机；第4部分：榛果：第5部分：杏仁；第7部分：巴西坚果； 第6部分：扁桃仁：第8部分：澳测坚果；第9部分：栗子第10部分：大豆；第12部分：花生： 第11部分：羽扇豆；第13部分：葵花籽：第14部分：芝麻；第15部分：大麦； 第16部分：小麦；第17部分：荞麦：第18部分：芥末：第19部分：胡萝卜；第21部分：牛奶： 第20部分：芹菜：第22部分：虾.
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第17部分：荞麦
1范围
SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原荞麦成分的环介导等温扩增（LAMP）检测方法.
本部分适用于食品及其原料中过敏原养麦成分的定性检测.本部分所规定方法的最低检测限（1OD）为0.5%（质量分数）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T1961.18-2013出口食品过敏原成分检测第18部分： 实时荧光PCR方法检测荞麦成分
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本3.1.1
过敏原allergen
又称致敏原或变应原，是指能够引 态反应的抗原3.1.2
荞麦buckwheat
学名：Fagopyrumesculentum，别名净肠草，蓼科荞麦属植物，粮食作物，其中甜荞（F.esculenrum）和苦荞（F.tataricum）是两种主要的栽培种.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件，dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）LAMP，环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification)TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚
4防污染措施
环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403-2008中附录D的规定.
5方法提要
样品经研磨后，提取DNA.以DNA为模板，采用荞麦过敏原蛋白基因特异性检测引物进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在养麦成分.
6LAMP检测方法
6.1原理
根据养麦过敏原蛋白基因序列设计内引物、外引物各一对，特异性识别靶序列上的6个独立区域.在链置换型DNA聚合酶的作用下，内引物与模板DNA退火、延伸，并利用外引物与模板DNA的退火、延伸，并利用外引物与模板DNA的退火延伸置换出内引物合成链.由于内引物与相邻区域存在互补区，游离的内引物合成链折叠成茎-环结构，以自身为模板，启动链置换扩增循环，合成长度不一的大 量茎-环结构DNA.加人显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果.DNA聚合反应析出的焦结果，
显色液显色原理：SYBRGreenI是一种结合于dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染料.在游离状态下，SYBRGreenI发出微鸦的荧光、但一旦与dsDNA结合后，荧光大大增强，因此， SYBRGreenI荧光的强度与dsDNA的量正相关，可以根据LAMP反应液的荧光强度测定反应体系中的 dsDNA 的量.
6.2仪器和设备
6.2.1超纯水发生器（分子生物学级别）.6.2.2水浴锅或加热模板：65C±1C和80C±1℃.6.2.3离心管：0.1mL、1.5ml6.2.4计时器.6.2.5移液枪：量程0.5μl~10pL、量程10μl~100pL、量程100pL~1000μl
6.3试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.6.3.2CTAB提取缓冲液（20g/L CTAB. 1. 4mol/LNaCl 0.1 mol/L.Tris-HCl.0.02 mol/L. 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格.Na EDTA.pH 8.0).6.3.3 CTAB 沉淀液(5 g/L. CTAB.40 mmol/L NaCl).6.3.4NaC1 溶液;1.2mmol/l6.3.5蛋白酶K（20mg/ml) 6.3.6dNTPs溶液：每种脱氧核糖核苷酸浓度10mmol/L6.3.7BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μ16.3.810×Thermol Pol缓冲液：含200mmol/L.Tris-HCl（pH 8.8）、100mmol/L.硫酸铵、100mmol/1.氯6.3.9硫酸镁溶液：50mmol/1 化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100.6.3.10甜菜碱溶液：5mol/L.6.3.11显色液：SYBRGreenI荧光染料.1000X.2
SN/T 4419.17-2016
6.3.12引物：根据荞麦过敏原蛋白基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3.内引物FIP/BIP，见表1.
表1引物序列
名称 编号 序列外侧上游引物（F3） 5'-ATCCTCGGACCGAGATGG-3'外侧下游引物（B3） 5′-AGTCCTTCTCTTCCTGCCT-3*LAMP引物序列 内侧上游引物（FIP） S'-CTCCGACAACCTGGACTCTTCCAACTTGAACGCGCACAGC-3'内侧下游引物（BIP） S'-AGTGTGTTCGACGACAACGTGCTCAACACCACTGCGAATCC-3*
6.4DNA提取
6.4.1称取100mg已制备好的样品至1.5mL离心管中，加人1mL.CTAB提取缓冲液和10pL.蛋白6.4.212000g离心10min.吸取上清液700pl至一新1.5mL离心管中. 酶K，65℃1h.期间每隔10min振荡混匀.6.4.3加人490μl氯仿，振荡混合后，12000g离心10min6.4.4吸取500μL上清液至一新1.5mL管中.6.4.5加人2倍体积CTAB沉淀液，混匀后室温静置60min.12000g离心10min.6.4.7加人350uL氯仿，高速激涡振荡混匀.12000g离心10min. 6.4.6弃去上清液，加人350pl.1.2mmol/LNaCl溶液充分溶解沉淀.6.4.8吸取上清液至一新1.5mL管中.加入0.8倍体积异丙醇，混匀，-20C静置20min，12000g离心10 min.6.4.9弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g离心10min.
6.4.10弃去上清液，晾干，加入100μLTE缓冲液，溶解DNA沉淀，-20“C保存备用.
6.5实验步骤
6.5.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板.
阳性对照：采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板.
设两个空白对照：
提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）：
LAMP反应的空白对照（以DNA溶解液代替DNA模板）.
6.5.2荞麦LAMP反应体系
LAMP反应体系见表2，每个样品各做2个平行管.加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中，不要粘附于管壁上.在反应体系配制完成后，将1pL显色液演在管盖内侧，盖管盖时应小心.防止显色液混合进入反应液中.
