中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第22部分：虾
Food allergen detection with LAMP methods for exportPart 22 :Shrimp
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成：
第1部分：开心果； 第2部分：腰果；第3部分：胡桃：第4部分：榛果；第5部分：杏仁： 第6部分：扁桃仁：第7部分：巴西坚果；第8部分：澳洲坚果；第9部分：栗子：第10部分：大豆； 第11部分：羽扇豆：第12部分：花生：第13部分：葵花籽：第14部分：芝麻： 第15部分：大麦：第16部分：小麦：第17部分：荞麦：第18部分：芥末：第20部分：芹菜； 第19部分：胡萝下：第21部分：牛奶；第22部分：虾
本部分为SN/T4419的第22部分
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司.
本部分主要起草人：徐君怡、曹际娟、陈颖、李一尘、肖嫌、郑秋月、刘冉、张璜.
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第22部分：虾
1范围
SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原虾成分的环介导等温扩增（1AMP）检测方法.本部分适用于食品及其原料中过敏原虾成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
过敏原allergen
3.1.2 又称致敏原或变应原，是指能够引
虾shrimp
属节肢动物门（Arthropoda甲尧亚门（Crusncen），种类很多，包括青虾、河虾、草虾、小龙虾、对虾、基围虾、琵琶虾等.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） LAMP：环介导等温扩增（loop-mediated isothermalamplifieation）
TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚
4防污染措施
环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403-2008中附录D的规定.
5方法提要
样品经研磨后，提取DNA.以DNA为模板，采用虾线粒体12SrRNA基因特异性检测引物进行
SN/T 4419.22-2016
LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原虾成分.
6LAMP检测方法
6.1原理
根据虾线粒体12SrRNA基因序列设计特异性内引物、外引物（和环引物）各一对，特异性识别靶序列上的6个或8个独立区域.在链置换型DNA聚合酶的作用下，内引物与模板DNA退火、延伸，并利 用外引物与模板DNA的退火延伸置换出内引物合成链.由于内引物与相邻区域存在互补区，游离的内引物合成链折叠成茎-环结构，以自身为模板启动链置换扩增循环，合成长度不一的大量茎-环结构DNA，加人显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果，DNA聚合反应析出的焦磷酸根离子与溶液中的Mg结合，形成焦磷酸镁乳白色沉淀，故也可通过反应液的浊度变化观察判定结果.
显色液显色原理：SYBRGreen1是一种结合于dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染料.在游离状态下.SYBRGrcen1发出微弱的荧光，但一且与dsDNA结合后，荧光大大增强，因此， SYBRGreenI荧光的强度与dsDNA的量正相关，可以根据IAMP反应液的荧光强度测定反应体系中的 dsDNA 的量.
6.2仪器和设备
6.2.1水浴锅或加热模板：65C±1C和80C土1℃.6.2.3计时器. 6.2.2离心管：0.1mL、1.5ml6.2.4移液枪：量程0.5pL~10μl量程10pL~100μL、量程100pL~1000μl
6.3试剂和材料
6.3.2 CTAB 提取缓 冲液（20 g/L. CTAB.1.4 mol/L NaC1. 0.1 mol/1.Tris-HC1 0 O2 mol/L 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格.Na; EDTA. pH 8 0).6.3.3CTAB沉淀液(5g/L CTAB.40 mmol/L NaCl).6.3.4NaC1 溶液:1.2 mmol/1. 6.3.5蛋白酶K（20mg/mL）.6.3.6dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L6.3.7BstDNA聚合酶：酶浓度8U/p1 6.3.810×ThcrmolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH 8.8）、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-1006.3.9硫酸镁溶液：50mmol/L6.3.10甜菜碱：5mol/1.6.3.12引物：根据虾线粒体12SrRNA基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3.内引物FIP/ 6.3.11显色液：SYBRGreen1荧光染料，1000×.BIP.见表1.
表1引物序列
名称 编号 序列外侧上游引物（F3）S-TAGAAACCGACCTGGCTC-3S'-TCATAAGATTAAGTTACTTTAGGGA-3′LAMP引物序列 外侧下游引物（B3）内侧上游引物（FIP） 0)S'-GCAGCAGTTATAAAGGAAGGTCT-CGGTCTGAACTCAAATCATGT-3'内侧下游引物（BIP） S'-CCTTAATTCAACATCGAGGTCG-ACAGCGTAATCTTCTTTGAGAG-3'
6.4DNA提取
6.4.1称取100mg已制备好的样品至1.5mL离心管中.加人1mlCTAB提取缓冲液和10μL蛋白6.4.212000g离心10min，吸取上清波700μl至一新1.5ml离心管中. 酶K.65C1h，期间每隔10min振荡混匀.6.4.3加人490μL氯仿，振荡混合后，12000g离心10min.6.4.4吸取500μl.上清液至一新1.5mL管中.6.4.5加人2倍体积CTAB沉淀液，混匀后室温静置60min.12000g离心10min.6.4.6弃去上清液，加入350μl.1.2mmol/L.NaCl溶液充分溶解沉淀.6.4.8吸取上清液至一新1.5mL管中.加人0.8倍体积异丙醇，混匀，-20C静置20min，12000g离 6.4.7加人350pL氯仿，高速激涡振荡混匀.12000g离心10min.心10 min 6.4.9弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g离心10min.
6.4.10弃去上清液，晾干，加人100μLTE缓冲液，溶解DNA沉淀，一20C保存备用.
6.5实验步骤
6.5.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板.
阳性对照：采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板.
设两个空白对照：
提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）：
LAMP反应的空白对照（以DNA溶解液代替DNA模板）.
6.5.2虾LAMP反应体系
LAMP反应体系见表2.每个样品各做2个平行管，加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中，不要粘附于管壁上.在反应体系配制完成后，将1μL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进人反应液中.
