中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4525.5-2016
出口食品中致病菌的分子分型 MILST方法 第5部分：克罗诺杆菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export foodPart 5:Cronobacter spp.
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：
本部分为SN/T4525的第5部分.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国南京出人境检验检疫局.
本部分主要起草人：王婷、陈颖、赵晓燕、蒋原、薛峰、赵晓美.
出口食品中致病菌的分子分型MLST方法 第5部分：克罗诺杆菌
1范围
SN/T4525的本部分规定了出口食品中克罗诺杆菌的分子分型MLST检测方法.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（世括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的. 礼是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB4789.40-2010食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验GB/T682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.3.1.1
细胞中均要表达的一 类基因 其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达.又称看家基因，持家基因.
3.1.2
Taq DNA南Thermus aquarieus DNApolymerase 从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合解
3.2缩略语
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） 下列缩略语适用于本文件.EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid）MLST：多位点序列分型（multilocus sequence typing）ST：序列型（Sequence Type)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]
4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编
SN/T 4525.5-2016
的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的 号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性.MILST分型中多个管家基因实验室间具有良好的可比性.
5试剂和材料
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
5.1Ex TaqDNA聚合酶.5.2 dNTP;dATP dTTP dCTP dGTP 5.4 10 × Ex Taq Buffer(20 mmol/L MgCl;). 5.3DNA提取试剂：DNA提取试剂盒.5.5琼脂糖.5.6TAE缓冲液：2 mol/LTris-HCI(pH 8.4)，1 mol/L 乙酸，100 mol/L EDTA5.7参考菌株：克罗诺杆菌ATCC29544.
6仪器和设备
6.1PCR扩增仪.6.3核酸蛋白分析仪.6.4电泳仪.6.5分子凝胶成像仅.6.6微量移液器和天菌吸头：10pl、100pL200pL、1000pL6.7恒温珞养箱. 6.8恒温水浴锅.6.9天平.6.10灭菌三角烧瓶：500ml.250ml.6.11灭菌平Ⅲ；90mm×15mm.6.12灭菌试管：内径3mm，长5cm.
6.2离心机，
7检测程序
增（引物序列见表A.2），对扩增结果阳性的样品进行克隆测序，将所得到的克罗诺杆菌7对管家基因测 对克罗诺杆菌7对管家基因atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、pps分别设计引物，并进行PCR扩序结果上下游序列整合后得到完整序列，将测序结果上传至MLST网站（hrtp：//
MLST的操作程序见图1.
图1MLST操作程序
8检测步骤
8.1提取细菌基因组DNA
取经过GB4789.40-2010鉴定为克罗诺杆菌的增菌液，提取基因组DNA.
8.2MLST基因选择
选择克罗诺杆菌的7个管家基因作为目的基因进行MLST分析，如表A.1所示，它们分别是ATPtRNA合成酶基因（Glutaminyl-tRNA synthetase.glnS）、谷氨酰胺合成酶大亚基基因（Glutamate syn- 合成β链基因（ATP synthase chain，atpD）、伸长因子G基因（Elongation factor fusA）、谷氨酰胺酰基-thase large subunit，gltB)、DNA 解旋酶 B亚基基因（DNA gyraseB，gyrB）、翻译起始因子 IF-2基因(Translation initiation factor IF-2infB)、确酸合成基因(Phosphoenol-pyruvate synthase pps).
8.3PCR引物和测序引物的选择
按照相应分子量进行稀释到10μmol/L，-20C保存备用. 针对表A.1中克罗诺杆菌7个目的基因，合成7对相应的PCR引物序列（表A.2）.引物在使用前
8.4目的基因片段的PCR扩增
反应体系体积为 50pl：10×ExTaq Buffer5μL、引物对（10μmol/L）各1μldNTP(2.5mmol/L)
