中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4747.2-2017
Determination of macrolide residues in live animal for import andexport-MIAmethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口. 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局.本部分主要起草人：王乃福、黄晨、吴冬雪、王万赛、刘洋、董志珍、赵祥平.
本部分是SN/T4747系列标准的第2部分.
进出口食用动物大环内酯类药物残留 量的测定微生物抑制法
1范围
SN/T4747的本部分规定了进出口食用动物大环内酯类兽药残留检测的试样制备和微生物抑制检测方法.
本部分适用于出入境检验检疫工作中进出口食用动物血液、尿液中大环内酯类兽药残留筛选检测，阳性结果需用其他方法进行确证.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析试验室用水规格和实验方法
3方法提要
试样经静置或离心后，取上清液加到含有 定数量藤黄微球菌的培养基中，利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生案、
4试剂与材料
4.1藤黄微球菌MicrococcusluteusCMCC
4.2保存和传代培养基：参见附录AA.1.
4.3增菌固体培养基：参见A.2.
4.4检定培养基：参见A.3.
4.5甲醇.
4.6磷酸盐缓冲液：称取0.523g确酸二氢钾（KHPO）及16.73g磷酸氢二钾（KHPO.），用蒸馏水溶解并定容至1000mL，121C高压灭菌15min.
4.7标准物质红霉素：纯度≥98%.
4.8红霉素标准储备液：10μg/mL.称取标准物质红霉素20.0mg（精确至0.1mg），先用少量甲醇溶解，再用磷酸盐缓冲液定容至2000mL，置2℃~8℃冰箱中保存，可使用7d.
4.9红霉素标准工作液：取红霉素标准储备液，用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL的标准工作液，须当日配制使用.
5仪器和设备
5.1培养Ⅲ：直径90mm.底部平整光滑，具陶瓦盖.
5.2离心机：最小离心力不小于4000g.
SN/T 4747.22017
5.3牛津杯：不锈钢，外径8mm±0.1mm，内径6mm±0.1mm，高度10mm±0.1mm. 5.4恒温培养箱：0℃~50℃，搁板应保持水平.5.5游标卡尺：测量范围为0mm~200mm，精度0.02mm；可采用抑菌圈测量仪或其他等效测量仪器.5.6电子天平：感量0.0001g.5.7高压灭菌器.5.8可调移液器：1μL~10μL 20μL~100μL 100μL~1000pL 5.9其他：试管、离心管、克氏瓶等.
6分析步骤
6.1试样制备
6.1.1血液：未加入抗凝剂的全血样品于室温（20C~22C）静置2h~4h（防止暴晒），取析出的血清进行检测；如无血清析出，将样液3000g离心15min后，取上清液进行检测.6.1.2尿样：样液经3000g离心15min后，取上清液进行检测.
6.2菌悬液的制备
将复活的菌种（参见附录B）接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，反复倾斜克氏瓶，使菌液均匀覆盖在培养基表面，30C培养18h士1h后，用10mL灭菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液，2℃~8C冰箱中保存，贮存期15d.
6.3菌悬液用量的测定
在实际测定前，将菌悬液进行10倍梯度稀释并分别加人到检定培养基中，制成平板，能使0.05μg/mL红霉素标准工作液产生大于或等于10mm清晰、完整的抑菌圈为最佳菌悬液用量.
6.4菌悬液用量的测定
检定用平板的制备：将检定培养基熔化后，冷却至45℃~50℃，加人适量菌悬液，混匀，立即取15mL，注人培养Ⅲ中，使培养基均匀覆盖在其底面，保持水平使其凝固.制备好的平板置2℃～8℃冰箱中保存，贮存期2d~3d.
6.5标准曲线的制备
红霉素标准工作液（4.3.5）0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/ml.0.8μg/mL五个浓度中，0.2μg/mL标准工作液作为参考浓度.
每个红霉素标准工作液浓度除参考浓度（0.2μg/mL）外，各取三个检定用平板为一组，四组共12个检定用平板，每个检定用平板中的3个牛津杯内加满参考浓度标准工作液，另3个牛津杯分别加满其他浓度的标准工作液.这样参考浓度（0.2pμg/mL）标准工作液将得出36个抑菌圈直径读数的数据，其 他浓度标准工作液将各得9个抑菌圈直径读数的数据.
将陶瓦盖盖好，置30C培养18h士1h，翻转平板，除去牛津杯，用游标卡尺准确地测量抑菌圈的直径（精确到0.1mm），求出各组平板中标准工作液浓度及参考浓度（0.2pg/mL）抑菌圈直径读数的平均减去各组参考浓度（0.2pg/mL）的平均值之差，即为每组平板的校正值.以此值校正其他各浓度标准 值以及参考浓度（0.2μg/mL）36个抑菌圈直径读数的总平均值.用参考浓度（0.2μg/mL）的总平均值工作液以及试样溶液抑菌圈直径读数的平均值.
将校正后的值，用式（1）、式（2）算出最低浓度抑菌圈直径（L）和最高浓度抑菌圈直径（H）.在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径（mm）为纵坐标（算术级），以标准工作液浓度（μg/mL）为横坐标（对数级），
标出L点和H点，通过L点和H点连一直线即为标准曲线.
（1）
式中：
L 标准曲线上最低浓度（0.05μg/mL）抑菌圈直径，单位为毫米（mm）： 标准曲线上最高浓度（0.8μg/mL）抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；H 参考浓度（0.2μg/mL）抑菌圈直径的总平均值，单位为毫米（mm）；a、b、d、e 分别表示标准曲线上其他浓度标准工作液（0.05μg/mL、0.1pg/mL、0.4pg/ml、0.8pg/mL）的抑菌圈直径经校正后的平均值，单位为毫米（mm）.
6.6测定
取制备好的检定用平板三个，在平板底部做好标记，把牛津杯适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过6个，在相间隔的3个牛津杯中滴满参考浓度标准工作液，另外3个牛津杯内加满被测样液，将 陶瓦盖盖好，置30C培养18h士1h，翻转平板，除去牛津杯，如有抑菌圈产生，准确测量其直径（精确到0.1mm），分别求出样液及参考浓度抑菌圈直径读数的平均值.
6.7结果的计算和报告
检定平板上样液不产生抑菌圈或抑菌圈直径<10mm，报告“阴性”. 检定平板上样液产生抑菌圈，抑菌圈直径≥10mm，报告“初筛阳性”.可按5.5要求校正后，从标准曲线上查出相应的红霉素含量（pg/mL）.必要时，尚需进行确证实验. 如果样品中红霉素的含量单位用mg/kg表示，可将ug/mL按式（3）进行换算. 式中： 样液中抗生素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）： X 从标准曲线上查出的样液中红霉素含量，单位为微克每毫升（μg/mL）：m c 最终样液中所代表的试样量，单位为克每毫升（g/mL）. 7测定低限 测定低限见表1. 表1测定低限 样品种类 大环内酯类兽药 测定低限/（mg/kg） 0 05泰乐菌素 红霉素 0 05螺旋莓索 0 05动物血液/尿液 林可霉素 0.05吉他霉素 0 05克林霉素 0 05
