中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4778-2017
出口花粉中链霉素和双氢链霉素的测定方法 液相色谱-质谱/质谱法
Determination of streptomycin and dihydrostreptomycin in pollen for exportLC-MS/MS method
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任. 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.本标准主要起草人：黄娟、刘艳、柳蓄、李静静、姜珊、陈惠兰、股耀、张晓燕、丁涛.
出口花粉中链霉素和双氢链霉素的测定方法 液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了出口花粉中链霉素和双氢链霉素的液相色谱-质谱/质谱法测定方法.
的测定和确证. 本标准适用于出口松花粉、玉米花粉、茶花粉、葵花粉、油菜花粉和杂花粉等中链霉素和双氢链霉素
2规范性文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
样品中的链霉素和双氢链霉素经提取溶液提取，三氯甲烷沉淀样品中的蛋白质，清液过C小柱净化后用液相色谱-质谱/质谱法测定.外标法定量.
4试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水采用GB/T6682中规定的一级水.
4.1甲醇：高效液相色谱级.
4.2磷酸.
4.4甲酸：高效液相色谱级.
4.5正已烷.
4.6三氯甲烷.
4.8庚烷磺酸钠（CHSONa）.
4.9磷酸钠[NaPO（HO）].
4.10提取溶液：准确称取10.1g庚烷磺酸钠（4.8），4.1g磷酸钠（4.9）.用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加5mL磷酸（4.2），用水定容至刻度.
4.11叔丁基甲基醚-正已烷溶液（41，体积比）：准确量取400mL叔丁基甲基醚（4.3），加人100mL正已烷（4.5），混合均匀.
4.12甲酸溶液（5%，体积比）：准确量取5mL甲酸（4.4）.加人至1000mL容量瓶中.用水定容至刻度.
4.130.02mol/L乙酸铵溶液：准确称取1.54g乙酸铵（4.7）.用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，用水定容至刻度.
SN/T 4778-2017
4.14甲醇水溶液（37.体积比）：准确量取300mL甲醇，加人700mL水，混合均匀.
4.15链霉素标准品[Streptomycin Sulfate，（CHNO）：（HSO），CAS No3810-74-0]纯度大于或等于98%.
4.16双氢链霉素标准品[Dihydrostreptomycin Sesquisulfate Hydrate，（C： HNO）：（HSO），CASNo：5490-27-7纯度大于或等于99%
4.17标准储备液：分别准确称取适量的链霉素、双氢链霉素标准品，用甲醇水溶液（4.14）配制成浓度为1mg/mL的标准储备溶液.0℃~4C保存.
4.18混合标准中间溶液：分别准确移取一定体积的链霉素、双氢链霉素标准储备液（4.17），用甲醇水溶液（4.14）稀释为10μg/mL.0℃~4C保存.
4.19混合标准工作液：准确移取一定体积的混合标准中间溶液（4.18），用甲醇水溶液（4.14）稀释成1.0pμg/mL，现用现配.
4.20Cu小柱：500mg，3mL，或相当者.
5仪器和设备
5.2分析天平：感量分别为0.01g和0.01mg.5.3高速离心机：8000r/min5.4超声振荡器， 5.5涡旋混合器.5.6氮吹仪.5.7具塞塑料离心管：50ml5.8SPE固相萃取装置.
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）
6试样制备和保存
取有代表性的样品约500g，用磨碎机全部磨碎并通过20目筛，混匀，均分成两份作为试样，分别装人洁净的容器内，密封，标明标记，于常温下保存.
在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.
7分析步骤
7.1样品处理
7.1.1提取
称取2g试样（精确到0.01g）置于50mL具塞塑料离心管中，加人提取溶液（4.10）20mL，三氯甲烷3mL.于涡旋混匀器上混合3min，混合均匀后置于超声振荡器中超声15min.8000r/min高速离 心5min.取上层清液收集于塑料离心管中，供净化用.
7.1.2净化
的流速全部通过C小柱，在样液在小柱上还剩约2mL左右时，加人5mL水以1滴/s~2滴/s的流速 将Cu小柱（预先用5mL甲醇，5mL水活化）连接于20mL塑料针筒下，将样液以1滴/s~2滴/s
淋洗小柱，直至空气流经小柱，弃去流出液.去除针简，加压抽干约3min后加3mL叔丁基甲基醚-正已烷溶液（4.11）以1滴/s~2滴/s的流速淋洗小柱，弃去流出液，加压抽干约5min后加人5mL甲醇以1滴/s的流速洗脱于10mL试管中.该洗脱液于45℃下氮气吹干，加人0.02mol/L.乙酸铵溶液1.0mL溶解残渣，充分涡旋混合后过0.45pm水相滤膜（4.21），供液相色谱-质谱/质谱仪测定.
7.1.3基质标准溶液的制备
称取5份约2g阴性试样（精确至0.01g）置于50mL具塞塑料离心管中，分别加人标准品工作液（4.19）10 pL20μL、50 μL、100 μL200 μl，余下操作同 7.1.1~7.1.2.
7.2测定
7.2.1液相色谱条件
液相色谱条件如下：
a）色谱柱：ProtemixWCX-NP5柱，2.1mmX100mm5μm或相当者：A中表A.1；c）流速：350μL/min；d）进样量：25μL； e）柱温：35℃.
b）流动相：5%甲酸溶液（4.12）、0.02mol/L乙酸铵溶液（4.13）和甲醇，梯度洗脱：梯度参见附录
7.2.2质谱条件
质谱条件如下：
a）离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI b）质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；c）其他参考质谱条件参见附录B中的表B.1.
7.2.3液相色谱-质谱/质谱测定
7.2.3.1定性测定
并且在扣除背景后所选择的两对离子对与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，其相对丰度允许偏差不 在上述色谱-质谱条件下，如果样品中检测的色谱峰保留时间与相应的标准品相差在士2.5%以内，超过表1规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物.
表1定性确证时相对离子丰度的最大允许误差
相对离子丰度（%基峰） %0S20%~50% >10%~20% 10允许的相对误差 ±20% ±25% ±30% ±50%
7.2.3.2定量测定
采用基质提取标准曲线测定样液中的被测物的含量.样品中被测物量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应适当稀释至标准曲线范围之内进行检测.标准溶液的多反应监测 （MRM）色谱图参见附录C中的图C.1.
