中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4818-2017
进出口食用动物中莱克多巴胺、 沙丁胺醇、盐酸克伦特罗的测定 酶联免疫吸附法
Determination ofractopaminesalbutamolclenbuterol hydrochloride in edibleanimal for imported and export-Enzyme linked immunosorbent assay method
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局. 本标准主要起草人：孙明君、孙涛、梁广辉、梁成珠、郑小龙、岳志芹、朱来华、徐彪.
进出口食用动物中莱克多巴胺、 沙丁胺醇、盐酸克伦特罗的测定 酶联免疫吸附法
1范围
本标准规定了进出口食用动物的血浆、尿液中莱克多巴胺、沙丁胺醇和盐酸克伦特罗残留检测的酶联免疫吸附测定方法.
本标准适用于进出口禽类的血液、畜类的血液及尿液中莱克多巴胺、沙丁胺醇和盐酸克伦特罗残留量快速筛选检测，适用于出入境检验检疫工作.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
利用抗原抗体特异性结合的特性和酶的高效催化作用，通过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP）与伦特罗抗体结合，使抗克伦特罗抗体固相化，然后加人待测克伦特罗和辣根过氧化物酶标记克伦特罗， 克伦特罗（CL）偶联，形成辣根过氧化物酶标记克伦特罗，将固相载体上已包被的抗体与特异性的抗克它们竞争性地与克伦特罗抗体结合，洗涤后加显色剂，根据显色剂的颜色变化计量待测克伦特罗量.若待测克伦特罗多，则被结合的酶标记克伦特罗少，显色剂颜色浅，反之则深，用目测法或比色法测定样品中的克伦特罗含量，比色的最佳波长为450nm
沙丁胺醇与莱克多巴胺原理同克伦特罗.
4试剂与材料
4.11mol/L氢氧化钠：配制参见附录A.试验用水应符合GB/T6682要求.4.2乙酸乙酯：分析纯. 4.3β-葡萄糖醛酸苷酶：含β-葡萄糖醛酸苷酶111000U/mL.4.4磷酸钾缓冲液.4.5硼酸盐缓冲液，4.6包被缓冲液.4.7洗涤缓冲液. 4.8封闭缓冲液，4.9稀释缓冲液.
4.10辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液.
SN/T 4818-2017
4.11底物液.
4.12显色剂液.
4.13终止液.
4.14抗抗体（克伦特罗为羊抗鼠IgG，沙丁胺醇、莱克多巴胺为兔抗绵羊IgG）.
4.15抗体（克伦特罗为鼠源单抗、沙丁胺醇和莱克多巴胺均为绵羊源多抗，抗体效价应>5000或有效 抗体含量应>5mg/mL、IC<1.0）. 4.16HRP偶联物（克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺3种，交联比为（6~12）：1，以偶联物浓溶液保存，使用前需用辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液稀释）. 4.17包被IgG抗体的聚苯乙烯微量96孔反应板. 4.18标准品：莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗（英文名称分别为：Ractopaminehydrochloride、Salbutamol sulfate.Clenbuterolhydrochloride)，纯度99%. 4.19标准品贮备液：准确称取标准品（折合成目标化合物10.0mg）.用适量甲醇溶解，并用甲醇定容至10mL，混勾.一18C以下避光保存.有效期为12个月. 4.20标准品中间液：用甲醇稀释标准储备液至10g/L.4C以下道光保存，有效期为6个月. 4.21标准品工作液：用稀释缓冲液稀释标准中间液至工作浓度0.1μg/L、0.3pg/L、0.9pg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，现用现配. 5仪器和设备 5.5微量移液器：单道20μL、50.100pl.和多道50pL~350l5.9旋转蒸发仪.5.10振荡器. 5.1分析天平：感量0.0001g. 5.2酶标仪，带有450nm滤光片. 5.3离心机：转数≥8000r/min. 5.4超声波发生器. 5.615mL离心管. 5.7酸度计：pH测量范图0~14 5.8涡旋式混合器. 6测定步骤 6.1试样制备和保存 6.1.1试样制备 份，装人洁净容器内，作为试样密封并标明标记. 分别取食用活动物的血液100mL放于抗凝血试管中、新鲜尿液样品约50mL，将样品分成两等 6.1.2试样保存 以下冷冻保存，在制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化. 所采集食用动物的尿液、血浆置于4C下保存备用，可保存3天~4天.若长期保存需将试样于-18℃ 6.2提取 取0.5mL样品于15mL螺纹离心管中，加人3mL磷酸钾缓冲液稀释.然后加人10μLβ-葡萄糖 醛酸酶，在37C条件下水解2h（或者在室温下过夜）.再加人2mL硼酸盐缓冲液，并用1mol/LNaOH调节pH至8~9.用3mL乙酸乙酯涡振荡萃取.室温（20℃~25℃）下，4000g离心10min.取上清液于新离心管中，60C蒸干.干燥残留物溶于0.5mLPBS缓冲液.每孔取50μL备用检测. 6.3酶联免疫测定 6.3.1根据待测样品数量和标准样品（每个样品2个平行），决定微孔的使用量.6.3.3将微孔内液体垂直倒摔，加人250μL洗涤缓冲液，轻轻晃动后垂直倒掉，再重复洗涤微孔3次，在滤纸上用力垂直磕掉残留在壁上的液体6.3.5重复6.3.3操作.6.3.6每个微孔中加人100pL的抗体，小心混合后在室温（20℃~25）下孵育15min.6.3.7重复6.3.3操作.6.3.8每个微孔加入50μL标准溶液或待测样品溶液，然后加人100μL辣根酶标记物，小心地充分混 合，室温（20℃~25℃）下孵育30min.6.3.9重复6.3.3操作.6.3.10每个微孔加人50μL底物液和50μL显色剂液，充分混合后在室温（20℃~25C）下暗处孵育15 min. 6.3.2每孔100L抗体包被板4C过夜. 6.3.4每孔加250μL2%牛血清白蛋白.37C封闭2h. 6.3.11每个微孔加人100pL终止液，充分混合后30min内于450nm处测量吸光度值， 6.4空自试验 除不加试样外，均按6.3测定步骤进行. 6.5质控试验 每次测定均应做一个用空白样品添加药物混合标样的质控样品，添加浓度应为相应产品的检测低限. 7结果计算 7.1标准曲线的绘制 将6个浓度的标准溶液（0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L）和待测溶液按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值.以0浓度的吸光度B0值为分母，其他标准浓度的吸光度B值为分子的比值，再乘以100，获得吸光度的百分比.以此吸光度百分比为纵坐标，对应的5个标准浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线.该定标模型在0.1μg/L~10μg/L范围内是线性的. 7.2百分吸光度值的计算 按式（1）计算百分吸光度值： 式中： B#品样品孔的平均吸光度值； B.一一零标准的平均吸光度值.
