中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4848.1-2017
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第1部分：荆条
Identification of mon honey plant species in export honey-Real-time PCR methodPart1:Chaste tree
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4848《出口蜂蜜中常见密源植物成分的检测方法实时灾光PCR法》分为8部分.
第1部分：剩条：第2部分：油菜；第3部分：洋槐； 第4部分：按树；第5部分：般树：第6部分：龙眼：第8部分：紫云英. 第7部分：荔枝和龙眼：
本部分为SN/T4848的第1部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局. 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分主要起草人：陈颖、杨艳歌、吴亚君、韩建助、黄文胜、张九凯、王斌、李想、刘鸣畅.
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法
实时荧光PCR法
第1部分：荆条
1范围
SN/T4848的本部分规定了 出口蜂蜜中荆条成分的实时荧光PCR检测方法.
（质量百分比）. 本部分适用于出口蜂蜜中荆条成分的定性检测，本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.5%
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的. 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T14963-2011食品安全国家标准蜂蜜
GB/T27403-2008实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.3.1
蜂蜜honey
蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混台后，经充分酿造而成的天然甜物质.
3.2
荆条chaste tree
荆条（ViternegundoL var.heterophylla（Franch.）Rehd），又名牡荆、黄荆柴、黄金子，马鞭草科、牡荆属植物，属马鞭草科黄荆变种.
3.3
实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析.
3.4
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
SN/T 4848.1-2017
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dGTP：脱氧乌苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid)Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）FAM：基荧光素（Carboxyfluorescein） TAMRA：胺基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhoda mine）BHQ1：黑洞猝灭基团 1(Black hole quencher 1)
CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）OD：光度密度（optical density）
5方法提要
提取样品DNA，以荆条来源DNA为阳性对照，以其它密源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照，使用特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在荆条成分.
6试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
6.1检测用引物和探针：荆条成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基团）引物和探针详见 表1.荆条引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1荆条基团扩增引物探针序列
物种名称 引物/探针序列（5′→3’） 扩增片段 靶基因长度F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(adhB)geneP;FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 F;GGAGCAATAAATTCTTTC荆条 R ACAATACCACTAAAAACGGGCT 89 bp PsbA(psbA)geneP;FAM-GAGGGGTTATTGCTCCTTTATTTT-TAMRA
三氯甲烷（氯仿）.6.2
6.3异丙醇.
6.4体积分数为70%的乙醇.6.5NaCl溶液（1.2mol/L).6.6蛋白酶K（20mg/mL).6.7CTAB 提取缓液：20 g/L CTAB.1.4 mol/L NaCI 0.1 mol/L Tris-HCl 0.02 mol/L NaEDTA pH8.0.6.8CTAB 沉淀液：5 g/L CTAB.40mmol/L NaC1.6.910×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4).200mmol/LKCl.15mmol/LMgCl6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5pL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1×PCR buffer、2.5mmol/L~4.0 mmol/1.的 Mg²0.2U~1 U 的UNG 、0.2 mmol/L. 的 d(A C.G) TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪无需ROX校正）.
7仪器设备
7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度针. 7.1实时荧光PCR仪.7.3恒温水浴锅.7.5微量移液器;0.5 pL~10 μL，10 μL~100 μL.20 μL~200μL..200μL~1 000μL.7.6恒温混匀仪. 7.7涡旋震荡器.7.8pH计.7.9量筒：容量50ml.7.10烘箱.
7.4离心机：离心力≥12000g.
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取
8.1.1.1蜂蜜样品50C水浴20min至充分融化，上下颜例混匀.8.1.1.2取20ml蜂蜜样品.分成2管.每管10mL于50mL离心管中.加人无菌双蒸水至30mL.涡旋混匀，4000r/min离心10min，吸出上清（4C贮存备用）.8.1.1.3沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2mL离心管中，12000r/min离心5min，去除上清. 8.1.1.4加人600gLCTAB提取缓冲液，置于65C恒温混匀仪中温育1h~2h.转速为650r/min；12000r/min离心10min.8.1.1.5转移上层清液至2ml离心管中：加人0.7倍体积的三氧甲烷，剧烈震荡混匀.室温下12000r/min离心10 min.8.1.1.6加入等体积CTAB沉淀液混匀.13000r/min离心10min. 8.1.1.7弃上清，加入350pL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶液沉淀.8.1.1.8加人0.8倍体积的异丙醇混匀，-20C放置0.5h~1h，12000r/min转速4C离心10min~15 min.8.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4C离心10min8.1.1.10弃上清，室温下晾干.加人50pL~100μL双蒸水，溶解沉淀，-20C保存.
