中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4848.3-2017
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第3部分：洋槐
Identification of mon honey plant species in export honey-Real-time PCR method-Part3:Locust tree
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4848《出口蜂蜜中需见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法》共分为8部分：
第1部分：荆条；第2部分：油菜；第3部分：洋槐； 第4部分：按树：第5部分：树；第6部分：龙眼；第7部分：荔枝和龙眼：第8部分：紫云英.
本部分为SN/T4848的第3部分
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口. 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局.本部分主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、黄文胜、韩建勋、张九凯、刘鸣畅、邓婷婷、宗凯.
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法
第3部分：洋槐
1范围
SN/T4848的本部分规定了出口蜂资中洋槐或分的实时荧光PCR检测方法.
本部分适用于出口蜂蜜中洋核成分的定性检测.本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.1%（质量百分比）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文3.1
蜂蜜honey
蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或密露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质.3.2
洋槐locust tree
实时荧光PCRreal timePCR
模板的定量及定性分析. 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始
3.4
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）
SN/T 4848.32017
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane]Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus） EDTA乙二胺四乙酸(Ethylene diaminetetraacetic acid)OD：光度密度（optical density）FAM：基荧光素（Carboxyfluorescein）TAMRA：羧基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhodamine）BHQ1：黑洞猝灭基团 1（Black hole quencherl)
5方法提要
白对照，使用特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在 提取样品DNA，以洋槐来源DNA为阳性对照，以其它蜜源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空洋槐成分.
6试剂和材料
用无DNA酶污桑的容器分装. 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均
6.1检测用引物和探针：洋槐成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.详槐引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1洋槐基因扩增引物探针序列
物种名称 引物/探针序列（5→3） 扩增片 段长度 基因F;GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA内参照 R;AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(ndhB)gene NADH dehydrogenaseP FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1F:GCTCAACCAGGAACGATC洋虎 R:GCAGCATTTGACTACGTACCA 112 hp maturase-lik protein (marK)geneP:FAM-CATAAACCTATTATCCGAACATTCATTTCA-TAMRA
6.2 三氯甲烷（氯仿）.6.3异丙醇，6.4体积分数为70%的乙醇.6.5NaCl溶液（1.2mol/L).
6.6蛋白酶K（20mg/mL）.6.7 CTAB 提取缓冲液:20 g/L CTAB 1.4 mol/L NaCI 0.1 mol/L Tris-HCI 0.02 mol/L Na EDTA pH 8 06.8CTAB沉淀液：5g/L CTAB.40mmol/LNaCl 6.910×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HC1(pH8.4)，200mmol/LKCl.15mmol/LMgCl6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5pL反应体系包括：1U~2U（Unit.酶学单位）的Taq酶、1×PCR buffer、2.5 mmol/L~4.0 mmol/L 的 Mg²*、0.2 U~1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A.C G)TPs、0.2mmol/L~0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/L ROX染料（某些荧光PCR 仅无需 ROX 校正）.
7仪器设备
7.1实时荧光PCR仪.7.2核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计. 7.3恒温水浴锅.7.4离心机：离心力≥12000g.7.5微量移液器；0.5μL~10pl，10μL~100pL，20μL~200pL.200 μL~1000 μl7.6恒温混匀仪，7.8pH计. 7.7涡旋震荡器.7.9量简：容量50ml..7.10烘箱.
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取
8.1.1.1蜂蜜样品50C水浴20min至充分融化，上下颠倒混匀.8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管，每管10ml于50ml离心管中，加人无菌双蒸水至30mL，涡旋混匀，4000r/min离心10min，吸出上清（4C贮存备用）.8.1.1.4加人600uLCTAB提取缓冲液，置于65C恒温混匀仅中温育1h~2h，转速为650r/min； 8.1.1.3沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2mL离心管中.12000r/min离心5min，去除上清.12 000r/min离心 10 min.8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中：加人0.7倍体积的三氧甲烷，剧烈震荡混匀.室温下12000r/8.1.1.6加人等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min. min离心10min 8.1.1.7弃上清，加人350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀.8.1.1.8加人0.8倍体积的异丙醇混匀，-20C放置0.5h~1h.12000r/min转速4℃离心10min~15 min. 8.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4℃离心10min.8.1.1.10弃上清，室温下晾干.加人50L~100μL双蒸水，溶解沉淀，一20C保存.
8.1.2蜂密上清DNA提取
将上清分装到2个50mL离心管中，每管20mL.参照附录B步骤进行核酸DNA提取，DNA存放
