中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4848.8-2017
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第8部分：紫云英
Identification of mon honey plant species in export honeyReal-timePCRmethod-Part8:MilkVetch
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4848（出口蜂蜜中常见密源植物成分的检测方法实时荧光PCR法》共分为8个部分：
第1部分：荆条；一第2部分：油菜：一第3部分：洋槐： 第4部分：楼树：一第5部分：般树：第6部分：龙眼：第8部分：紫云英. 第7部分：荔枝和龙眼：
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安微出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局.
本部分主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、黄文胜、张九凯、刘鸣畅、韩建助、宗凯、李想、王斌.
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第8部分：紫云英
1范围
SN/T4848的本部分规定了出 口蜂蜜中常云英成分的实时荧光PCR检测方法.
0.1%（质量百分比）. 本部分适用于出口蜂蜜中紫云英成分的定性检测.本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其是新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水靓格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1
蜂蜜honey
蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或密露，与自身分泌物混合后，经充分酿造面成的天然甜物质.
紫云英milkvetch
紫云英（Astragalus sinicusL)，又名插播红花草，豆科，黄香属植物.
3.3
实时荧光PCRrealtimePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析.
3.4
Ci值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dTTP：脱氧胸三磷酸（deoxythymidine triphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethylaminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid)Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）OD：光度密度（optical density）FAM：俊基荧光素（Carboxyfluorescein）TAMRA：基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhoda mine）BHQ1：黑洞猝灭基团1（Blackhole quencher 1）
5方法提要
空白对照，使用特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，观察实时 提取样品DNA，以紫云英源性DNA为阳性对照，以其他蜜源植物DNA为阴性对照，无菌水作为荧光PCR的增幅现象判定是否存在紫云英成分.
6试剂和材料
用无DNA酶污染的容器分装. 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均
6.1检测用引物和探针：紫云英成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.紫云英引物扩增的靶标序列参见附录A
表1紫云英基因扩增引物探针序列
扩增片物种名称 引物/探针序列（5→3'） 段长度 把基园F GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase内参照 R AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(ndhB)geneP;FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1F;CGAAATGTCAAAAGCATAAAACG NADH dehydrogenase紫云英 R;ATTCCATCTTGGCTGAAAGAAAT 176 bp subunit F(ndkF ) geneP:FAM-TTCCAATGGACCCAACGAAGAAAGTAAATAA-TAMRA
6.2三氧甲烷（氯仿）.6.3异丙醇.6.4体积分数为70%的乙醇.
6.5NaCl溶液（1.2mol/L）.6.6蛋白酶K（20mg/ml).6.7CTAB 提取缓冲液：20 g/L CTAB.1.4 mol/L NaCI 0.1 mol/L Tris-HC1 0.02 mol/1L Na EDTA pH 8.0. 6.8CTAB沉淀液：5g/L CTAB.40mmol/LNsCl.6.910×PCR缓冲液;200mmol/L Tris-HCl(pH 8.4).200 mmol/1KC1.15 mmol/L MgCl.6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5pL反应体系包括；1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的 Mg、0.2 U~1 U的 UNG酶、0.2mmol/L的 d（A，C G)TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/L.dUTP、400nmol/L.ROX染料（某些荧光PCR仪无需ROX校正）.
7仪器设备
7.1实时荧光PCR仪7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计. 7.3恒温水浴锅7.4离心机：离心力≥12000g.7.5微量移液器：0.5μL~10 μL，10μl~100μL.20μL~200μL 200gxl~1 000μl.7.6恒温混匀仪. 7.7涡旋震荡器.7.8pH计.7.9量简：容量50ml..7.10烘箱.
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取
8.1.1.1蜂蜜样品50C水浴20min至充分融化，上下频倒温匀.8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管.每管10mL于50mL离心管中.加人无菌双蒸水至30mL，涡旋混匀.4000r/min离心10min，吸出上清（4C贮存备用）.8.1.1.4加人600pLCTAB提取缓冲液，置于65C恒温混匀仪中温育1h~2h，转速为650r/min； 12 000 r/min离心10 min.8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中.加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min8.1.1.6加人等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min. 8.1.1.7弃上清，加人350gL.1.2mol/LNsCl溶液，充分溶解沉淀，8.1.1.8加人0.8倍体积的异丙醇混匀，-20C放置0.5h~1h.12000r/min转速4℃离心10min~15 min 8.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4C离心10min，8.1.1.10弃上清，室温下晾干，加人50pL~100gL双蒸水，溶解沉淀，一20C保存.
