中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4853.6-2017
转基因大米定量检测 数字PCR法 第6部分：T2A-1品系
Quantitative detection ofgeneticallymodifiedrice-DigitalPCR-Part 6:EventT2A-1
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4853（转基因大米定量检测数字PCR法》系列标准共分为7部分：
第1部分：TT51-1品系；第2部分：克螺稻品系：第3部分：科丰6号品系： 第4部分：M12品系：第5部分：LL62品系；第6部分：T2A-1品系；第7部分：T1C-19品系本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分为SN/T4853标准的第6部分.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口，本部分主要起草人：李想、刘月明、高琴、邓婷婷、黄文胜、林拥军、陈旋、陈颖、杨捷琳. 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局.
SN/T 4853.6-2017
3.1.6
质控样品qualitycontrolsample
具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的基因组DNA.3.1.7
微反应体系tinyreaction system
将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系.
3.1.8
转换系数Conversionfactor
3.1.9
荧光标记探针Fluorescentlytaggedprobe
在5末端和3'末端分别连接荧光报告基团和漳灭基团的寡核苷酸.PCR扩增时，Taq酶的5'-3外切酶活性将探针水解，使报告基团和灭基团分离，从而释放出荧光信号.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件，数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） bp:碱基对（base pair)NC：阴性对照（negaitive control)NTC：空白对照（no template control）PC：阳性对照（positive control)
4防污染措施
数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定.
5原理
数字PCR（digitalPCR）是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数的测定.通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反 应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中：微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定的荧光阔值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的模板浓度.
specificgene）的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量. 依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（event specificsequence）和内参照基因（species
6仪器和设备
6.1超纯水发生器（分子生物学级别）.
2
6.3生物安全柜.6.4PCR扩增仪.6.5数字PCR系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具6.6恒温孵育箱：控温精度土1.0℃. 有同样功能的仪器.6.7样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60目左右的粉末.6.8核酸定量仪：Nanodrop3000或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪.6.9涡旋振荡仪.6.10离心机：最大离心加速度大于15000g，并适用0.2mL和1.5mL离心管.6.11移液枪：量程0.5μL~10μL;量程10μL~100μL;量程100L~1000μl.
6.2分析天平：感量0.1g和0.1mg.
7试剂和材料
除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T19495.1的要求.
7.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格. 7.2数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5'-3'外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字PCR专用预混试剂7.3引物和探针：SPS基因和T2A-1转化体特异性序列的数字PCR检测引物和探针信息详见表1.7.4数字PCR微反应体系生成联排管或芯片.7.60.2mL和1.5mL离心管. 7.596孔荧光定量PCR反应板和封膜.7.7移液枪头，量程0.5pL~10pl;量程10pL~100pL；量程100μL~1000μl
表1SPS基因和T2A-1转化体特异性序列的引物和探针
扩增基因 名称 序列（5'-3’） PCR扩增片段长度上游引物 GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTGSS 下游引物 GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC 122 bp探针 VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1上游引物 AAAGCTAGCCTCGTTTATTCCTT2A-1转化体 特异性序列 下游引物 CTAGCGTTCGTACAGTTTAAGCT dq 26探针 FAM-CAACGAATCTTCCTGTCTGCCTGCT-BHQ1注1：表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整.注2：荧光探针的发光基团应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5'-FAM/3-BHQI或5'-VIC/3-BHQ1方注3：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至 式标记.10μmol/L后分装，-20C避光保存
