中华人民共和国国家标准
GB7918.4-87
化妆品微生物标准检验方法 绿 脓 杆菌
Standardmethodsofmicrobiologicalexamination for cosmeticsPseudomonas aeruginosa
中华人民共和国卫生部 发布
中华人民共和国国家标准
UDC668.58576. 85. 07
化妆品微生物标准检验方法 绿脓 杆 菌
GB7918.4-87
Standard methods of microbiologicalexamination for cosmetiesPseudomonas aeruginosa
绿杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，对人有致病力，常引起人皮肤化感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌.
1方法提要
根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素.此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42C条件下生长等，可与类似菌相区别.
2培养基和试剂
2.1SCDLP液体培养基
见GB7918.1-87（化妆品微生物标准检验方法总则），
2.2十六烷三甲基澳化铵培养基
成分：牛肉膏 3g蛋白腺 氧化钠 5g 10g十六烷三甲基澳化铵 0.3g20g蒸馏水 1000ml
制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4~7.6，加入琼脂，115C（10ib）20min灭菌后，制成平板备用.
2.3乙酰胺塔养基
成分：乙酰胺 氯化钠 5.0g 10.0g无水磷酸氢二钾 1.396无水磷酸二氢钾 0.736硫酸镁（MgS0.7H O) 0.5g琼脂 酚红 0.012g 20g蒸馏水 1000ml
（151b）20min高压灭菌后，制成平板备用.
2.4绿脓菌色素测定用培养基
成分：蛋白陈 20g氯化镇 硫酸钾 1. 4g 10g琼脂 18g甘油（化学纯） 10g蒸馏水 1000ml
制法：将蛋白陈、氯化镁和硫酸钾加到蒸缩水中，加温使溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115C（10Ib）20min高压灭菌后，制成斜面备用，
2.5明胶培养基
成分：牛肉膏 3g蛋白陈 明胶 5g 120g蒸馏水 1000ml
制法：取各成分加在蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4.分装于试管内，经115C（10Ib）20min灭菌后，直立制成高层备用.
2.6硝酸盐蛋白陈水培养基
成分：蛋白陈 10g酵母浸膏 3g硝酸钾 2g亚硝酸钠 蒸馏水 0.5g 1000ml
制法：将蛋白陈和醇母浸膏加到蒸水中，加温使溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小侧管的试管中，115C（10Ib）20min灭菌后备用.
2.7普通琼脂斜面培养基
成分：蛋白陈 牛肉膏 3g 10g氯化钠 5g琼脂 15g蒸馏水 1000ml
制法：除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2~7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，121C（151b）15min高压灭菌后，制成斜面备用.
3仅器
3.1培养箱：37C、42C. 3.2锥形烧瓶.3.3试管.3.4灭菌平Ⅲ.3.5灭菌刻度吸管. 3.6显微镜.3.7载玻片.3.8接种针、接种环.
3.9电炉.
3.10高压消毒锅.
4操作步骤
4.1增菌培养：取1：10样品稀释液10ml加到90mlSCDLP液体培养基中，置37C培养18~24h.如有绿杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色.
注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基，检验含防腐剂的化妆品时，在每1000ml普通肉汤中加1g磷脂、7g吐湿80.
4.2分离培养：从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基澳化铵琼脂平板上，置37C培养18～24h.凡绿继杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润， 菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差.
在缺乏十六烷三甲基澳化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分高，将菌液划线接种于平皿中，放37C培养24h，绿杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长.
4.3染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化瓣试验，
4.4氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试，在15~30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性.
入氯仿3~5ml，充分振荡使培养物中的绿菌素溶解于氧仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1N的盐酸1ml左右，振荡后，静置片刻，如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿菌素存在，
4.6硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐陈水培养基中，置37C培养24h，现察结果.凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氢气.
取出故冰箱10~30min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性. 4.7明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37C培养24h，
4.842C生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42C培养箱中，培养24~48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单题菌则不能生长.
5检验结果报告
被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿杆菌，如绿脓菌素试验阴性面液化明胶、硝酸盐还原产气和42C生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿脓杆菌.
附加说朝：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口.本标准由“化枚品微生物标准检验方法”起草小组起草. 本标准主要起草人周淑玉，本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负资解释，
