GB/T 14643.4-2009
前言
GB/T14643《工业循环冷却水中菌藻的测定方法》分为以下几个部分： 一第1部分：黏液形成菌的测定平Ⅲ计数法 一第2部分：土壤菌群的测定平Ⅲ计数法 第3部分：黏泥真菌的测定平Ⅲ计数法 -第4部分：土壤真菌的测定平Ⅲ计数法 第5部分：硫酸盐还原菌的测定MPN法 第6部分：铁细菌的测定MPN法 本部分为GB/T14643的第4部分。
本部分代替GB/T14643.4-1993（工业循环冷却水中土壤真菌的测定平Ⅲ计数法》。
本部分与GB/T14643.4-1993相比，在技术内容上并无变化，只是对文本结构和文字进行了 修改。
本部分由中国石油和化学工业协会提出。
本部分由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会（SAC/TC63/SC5）归口。
本部分负责起草单位：中海油天津化工研究设计院、天津正达科技有限责任公司。
本部分主要起草人：白莹、张全、邵宏谦。
本部分于1993年首次发布。
GB/T 14643.4-2009
工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第4部分：土壤真菌的测定平血计数法
1范围 GB/T14643的本部分规定了工业循环冷却水中土壤真菌的测定方法。
本部分适用于工业循环冷却水中土壤真菌的测定也适用于原水、生活用水及其他水中土壤真菌的 测定。
2规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T14643的本部分的引用而成为本部分的条款。
凡是注日期的引用文 件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。
GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（GB/T603-2002,ISO6353-1；1982， NEQ)
3方法提要 本部分采用土壤真菌培养基，用平Ⅲ计数技术，在（29土1）C培养72h，测定工业循环冷却水中土 壤真菌的总数。
本部分所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682中三级水的规定。
试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603之规定制备。
4.1马铃薯：市售新鲜（无芽），去皮后切成约20mm×20mm×20mm小块。
4.2葡萄糖。
4.3琼脂：生物试剂. 4.4氯化钠。
4.5乳酸， 4.6乙醇溶液：75%（体积分数）。
4.7硫代硫酸钠。
4.8牛皮纸. 4.9医用脱脂棉。
4.10医用脱脂纱布， 5仪器、设备 5.1无菌箱（室）或超净工作台。
5.2蒸汽压力灭菌器。
5.3生化培养箱。
GB/T 14643.4-2009 5.4鼓风电热干燥箱：温度可控制在60C~280C， 5.5铝锅：200mm. 5.6搪瓷量杯：1000mL。
5.7磨口三角瓶：1000ml. 5.8培养Ⅲ：90mm. 5.9磨口试剂瓶：1000ml. 5.10刻度吸管：1mL。
5.11刻度吸管：5mL 5.12三角瓶：500mL 6试验前的准备 6.1培养基的制备 称取约200g的马铃薯于铝锅中，加水约1000mL在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱 布过滤到搪瓷量杯中，收集到约900mL滤液，滤液搅匀待用。
于上述滤液中加人20.0g琼脂和20.0g 葡萄糖，并放在电炉上加热，不断地搅拌，待琼脂完全溶化后趁热用四层医用脱脂纱布过滤于糖瓷量杯 中，用热水补充至1000mL，并用乳酸调节pH至4.0土0.1，并分装在500mL三角瓶中，每瓶分装量不 超过其总量的2/3，塞上棉塞，再用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于（121士1）C灭菌15min。
6.2无菌稀释水的制备 6.2.1生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解在1000mL水中，混匀。
6.2.2将生理盐水分装在100mL磨口三角瓶中.每瓶45mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插人一小纸 片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于（121士1）C灭菌 15 min, 6.3刻度吸管的灭菌 6.3.1将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉.棉花量要适宜，长度大约10mm~15mm，棉花不 宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。
6.3.2每支刻度吸管用一条约40mm~50mm宽的牛皮纸条，以45左右角度螺旋形卷起来，吸管的 尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支捆成一束，置电热干燥箱中于 （160±2）C灭菌2h 6.4培养皿的灭菌 将洗净并烘干后的培养Ⅲ10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中于（160士2）C 灭菌2h. 6.5采样瓶的灭菌 将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱中于 （160±2）C灭菌2 h。
6.6硫代硫酸钠的灭菌 将硫代硫酸钠放人无菌箱（室）内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处，灭菌30min。
7测定步骤 7.1水样的采集 7.1.1用无菌采样瓶采集被测样品，在采样过程中要保护瓶口和瓶颈，防止这些部分受杂菌污染，瓶内 要留下足够的空间，以备测定前摇动。
7.1.2若采集的水中有余氯，应在采样前，在无菌操作下于无菌采样瓶中加人灭过菌的硫代硫酸钠，加 人量为每升水样约0.1g。
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GB/T 14643.4-2009 7.1.3水样采集后应立即进行测定，如果2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，于4C~10C 保存，保存时间不宜超过24h.经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，于30C左右活化4h~ 5h再进行测定。
7.2无菌箱（室）灭菌 把实验所用的无菌稀释水、无菌培养Ⅲ、无菌吸管等用品放人无菌箱（室）内，打开紫外线灯灭菌 30 min。
7.3水样的稀释和接种 7.3.1关掉紫外线灯，打开荧光灯，将待测水样放入无菌箱（室）中，立即用75%的乙醇溶液浸泡的医 用脱脂棉擦手，点燃无菌箱（室）内的酒精灯。
以下对水样的稀释和接种的操作应在无菌箱（室）内的火焰区进行。
7.3.2选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种后培养Ⅲ中生长的菌落数小于300个，在空白稀 释水样瓶上标上稀释倍数。
7.3.3用10倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸管吸取5mL水样注入到45mL空白稀释水中充分 摇匀，此时稀释度为10-。
7.3.4另取一支5mL无菌吸管吸取5mL10水样注人到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为 10，依次类推，直至需要的稀释度为止。
7.3.5将不同稀释度的水样分别接种到无菌培养Ⅲ中，每个稀释度重复接种3～5个Ⅲ，每Ⅲ接种 1mL，接种时左手掌托住培养Ⅲ，大拇指和食指轻轻将培养Ⅲ提起，吸管与培养Ⅲ底成45”角相接。
移 开吸管时，吸管不宜再碰到培养Ⅲ，接种时间不宜超过48。
每接种一个稀释度更换一支无菌吸管。
7.3.6另取一组培养Ⅲ不接水样，作为空白，同时操作。
7.3.7将灭过菌的培养基冷却至（45士1）C，按7.3.5的方法撤开培养皿盖，将培养基灌人培养Ⅲ内， 每Ⅲ应灌15mL～20mL。
灌Ⅲ时不要使培养基直接灌在水样上，灌Ⅲ后要将融化的培养基和Ⅲ中水 样彻底混合，小心勿使混合液溅到培养Ⅲ的边缘。
测定一个水样从接种到灌Ⅲ不得超过20min. 7.4培养 待培养Ⅲ中培养基固化后，倒置平Ⅲ，在生化培养箱中（29士1）C培养72h。
8计数与报告 8.1培养之后，取出培养Ⅲ，若空白培养Ⅲ内出现菌落，表明测定过程中有污染，本次测定无效。
8.2选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均菌落数，并修约成二位有效数 字（见表1示例1）。
报告其平均数，若大于2则报告其中较小的数字（见表1示例2及示例3）。
8.4若稀释度的平均菌落数均大于300，则应选择稀释度最高的培养Ⅲ计数（见表1示例4）. 8.5若稀释度的平均菌落数均小于30，则应选择稀释度最低的培养Ⅲ计数（见表1示例5）。
8.6若稀释度均无菌落生长，则以"小于1乘以最低稀释倍数"报告之（见表1示例6）。
8.7若稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300面另一部分小于30时，则 选择最接近30或300的培养Ⅲ计数（见表1示例7）。
8.8土壤真菌的总数以p表示，单位为个每毫升（个/mL），按式（1）计算： X 式中： X；--计数得出的培养Ⅲ上长出的平均菌落数，个； F计数组的样品稀释倍数。
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