中华人民共和国国家标准
GB/T 15400-2018代替GB/T15400-1994
Determination of tryptophan in feeds
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准代替GB/T15400-1994《饲料中色氨酸的测定分光光度法》.本标准与GB/T15400-1994相比，除编辑性修改外，主要技术内容的变化：一增加了高效液相色谱法，修改了适用对象，增加了两个方法的定量限（见第1章，1994年版的 第1章）.一修改了分光光度法原理的表述（见4.1，1994年版的第3章）.-修改了精密度的表述（见4.7，1994年版的8.3）.本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口. 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心（北京）、通威股份有限公司.本标准主要起草人：李兰、贾争、赵艳、赵根龙、宋军、张风秤.本标准的历次版本发布情况为：-GB/T 154001994.
饲料中色氨酸的测定
1范围
本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中色氨酸的测定.
光光度法的定量限为0.04%，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6433饲料中粗脂肪的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3高效液相色谱法（仲裁法）
3.1原理
试样中的色氨酸经氢氧化锂溶液水解，用高效液相色谱法分离，紫外或荧光检测器检测，外标法定量.
3.2试剂或材料
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯.
3.2.1水：符合GB/T6682中一级水的规定.3.2.2甲醇：色谱纯.3.2.3氢氧化钾溶液（0.1mol/1）：称取0.56g氢氧化钾，溶解于100mL水中，即得.3.2.5乙酸钠缓冲溶液（0.0085mol/LNa，pH=4.5）：称取0.70g无水乙酸钠，溶解于1000mL水 3.2.4氢氧化锂溶液（4mol/L）：称取83.9g氢氧化锂，溶解于500mL水中，即得.中，用冰乙酸调节pH为4.5.3.2.6流动相：乙酸钠缓冲溶液（3.2.5）甲醇（3.2.2）=955于25mL烧杯中，用滴管滴加氢氧化钾溶液（3.2.3）使其溶解，将其定量地转移至250mL棕色容量瓶 中，用水定容，浓度为100μg/ml.2℃～8C保存，有效期为1个月.3.2.8L-色氨酸标准系列溶液：准确移取L-色氨酸标准储备溶液（3.2.7）5.00mL、7.50ml、10.00mL、12.50mL、15.00mL、17.50mL分别置于25mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀.其溶液浓度分别为 20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL和70μg/mL.2℃~8C保存，有效期为2周.
3.3仪器设备
3.3.1天平：感量0.0001g、感量0.001g.3.3.2聚四氟乙烯水解管：配衬管和密封垫.3.3.4离心机：转速不低于4000r/min. 3.3.3恒温干燥箱：可达到110℃土2℃C.3.3.5高效液相色谱仪：配紫外检测器或者荧光检测器.
3.4样品
样，磨碎，全部通过0.25mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，备用.取适量试样，按照GB/T6433测定试 按GB/T14699.1的规定，抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样.按GB/T20195制备试样脂肪含量.
3.5试验步骤
3.5.1脂肪含量小于4%的试样
平行做两份试验.称取未脱脂试样50mg～100mg（精确至0.0001g），置于聚四氟乙烯水解管（3.3.2）衬管中，加1.5mL氢氧化锂溶液（3.2.4），充氮1min，旋紧密封盖后放人110℃C土2℃C恒温干25mL容量瓶中，并用上述缓冲溶液定容，离心或者过0.45gm滤膜后上液相色谱仪测定. 燥箱（3.3.3）中，水解20h.取出水解管，冷却至室温，用乙酸钠缓冲溶液（3.2.5）将水解液定量地转移至
3.5.2脂肪含量大于4%的试样
称取脱脂后的试样，按照3.5.1步骤进行水解，
3.5.3参考色谱条件
色谱柱：C，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm，或性能相当者.流动相：见3.2.6.流速：1.0 mL/min.柱温：室温. 进样体积：10pL~20μL检测器：紫外或二极管矩阵检测器，检测波长280nm.荧光检测器激发波长：283nm：发射波长：343nm.
3.5.4测定
按上述规定的色谱条件平衡色谱柱，向色谱柱注人相应的色氨酸标准系列溶液（3.2.8）和试样溶液（3.5.1或3.5.2），以保留时间定性：在线性范围内，用外标法单点校正定量.色氨酸标准溶液色谱图参见附录A中图A.1.
3.6试验数据处理
3.6.1未脱脂试样中的色氨酸含量以质量分数w：计，数值以克每100克表示，按式（1）计算：
式中：
A 试样溶液峰面积值：V 一试样稀释体积，单位为毫升（mL）：P 色氨酸对照品溶液的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）：A，色氨酸对照品溶液峰面积平均值； V. 色氨酸对照品溶液进样体积，单位为微升（pL）；（试样质量，单位为克（g）；V.（-试样溶液进样体积，单位为微升（pL).
3.6.2脱脂试样中的色氨酸含量以质量分数w：计，数值以克每100克表示，按式（2）计算：
式中：
F脂肪含量，%.
式中其他参数同式（1）解释.
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位小数.
3.7精密度
0.01%.当试样中色氨酸含量在0.1%~0.5%时，两次独立测定结果与其平均值的绝对差值，应不大于 在重复性条件下，当试样中色氨酸含量小于0.1%时，两次独立测定结果的绝对差值应不大于该平均值的3%，当试样中色氨酸含量大于0.5%时，两次独立测定结果与其平均值的绝对差值，应不大于该平均值的2%.
4分光光度法
4.1原理
铜料中蛋白质经碱水解后，降解成多肽和游离的氨基酸.在硫酸介质中、氧化剂亚硝酸钠存在下，色氨酸与对二甲氨基苯甲醛缩合反应生成蓝色化合物，其吸光度在一定范围内与色氨酸含量成正比.
4.2试剂或材料
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯.
4.2.1水：符合GB/T6682中二级水的规定，4.2.2氢氧化钾溶液（10%）：称取100g氢氧化钾，溶解于1000mL水中，即得.4.2.3硫酸溶液（21.2mol/L）：量取589mL硫酸，缓慢加人约350mL水中，冷却后用水稀释至1L. 4.2.4对二甲氨基苯甲醛溶液：称取1.0g对二甲氨基苯甲醛溶于硫酸（4.2.3）中并定容至100mL，临用现配.4.2.5亚硝酸钠溶液（0.2%）：称取0.1g亚硝酸钠，溶解于50mL水中.临用时制备.4.2.6L-色氨酸标准储备溶液：同3.2.74.2.7L-色氨酸标准系列溶液：同3.2.8
4.3仪器设备
4.3.1天平：同3.3.1.4.3.3离心机：同3.3.4. 4.3.2培养箱：40℃±2C
