中华人民共和国国家标准
GB/T 15441-1995
水质急性毒性的测定发光细菌法
Waterquality-Determination oftheacute toxicity-Luminescentbacteria test
国家局 发布
中华人民共和国国家标准
GB/T 15441-1995
水质急性毒性的测定发光细菌法
Water quality-Determination of the acute toxicity-Luminescent bacteria test
1主题内客与适用范围
1.1主题内容
本标准规定了测定水环境急性毒性的发光细菌法.
本标准适用于工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测.
2方法提要
基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关（P≤0.05），因面可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平.
水质急性毒性水平按8所述条件选用相当的参比毒物氯化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选用EC值（半数有效浓度一以样品液百分浓度为单位）来表征.
3试剂和材料
本标准所用试剂除另有说明外，均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸端水或同等纯度的水.
3.1氯化汞HgCl
3.2氯化钠NaCI，化学纯.
3.3明亮发光杆菌T，小种（PhotobacteriumphosphoreumT，spp.）冻干粉，安瓶瓶包装，每瓶0.5g，在2~5℃冰箱内有效保存期为6个月.新制备的发光细菌休眠细胞（冻干粉）密度不低于每克800万个细胞；当按6.2.4步骤将冻干粉复苏2min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后每毫升菌液不低于1.6万个细胞（5ml测试管）或2万个细胞（2ml测试管）（均为稀释平板法测定）.在于1900mV允许将倍率调至“X0.5"档.仍达不到标准者，更换冻干粉.
3.5氯化钠溶液，2g/100ml.
氯化钠2g，加蒸馏水100ml，于试剂瓶内，2~5C保存.
3.6参比毒物氯化汞标准溶液.
0. 02 0 04 0 06 0. 08 0. 10 0. 12 0.14 0. 16 0.18 0.20 0. 22 0.24 mg/L.
3.7氯化汞母液，p=2000mg/L.
氯化钠溶液稀释至刻度，置2~5℃冰箱备用，保存期6个月. 万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000g入50ml容量瓶，用3g/100ml
3.8氯化汞工作液、p=2mg/L.
用移液管吸氯化汞2000mg/L母液10ml入1000ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容.再用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml人250ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3g/100ml氯化钠溶液将氰化汞2mg/L溶液按表1稀释成系列浓度（一律采用50ml容量瓶）.这些氯化汞稀释液保存期不超过24h，超过者务必重配.
表1氯化汞工作溶液稀释配制系列（在50ml容量瓶中）
加氯化录（2mg/L.）数，ml20220020810910021001080090000200
4仪器
4.1生物发光光度计.
配置2或5ml测试管.
当氯化汞标准溶液浓度为0.10mg/L时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过土10%.
4.22ml或5ml测试样品管（具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造），分别适用于相应型号的生物发光光度计.
4.3微量注射器：10gl.4.4注射器：1ml.4.5定量加液瓶：5ml.4.6吸管：2、10、25ml 4.7试剂瓶：100ml4.8量筒：100.500ml4.9棕色容量瓶：50、250、1000ml.
4.10半微量滴定管（配磨口试液瓶，全套仅器均为棕色）：10ml.
5样品
5.1样品的采集和保存
a.采样瓶使用带有聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶，务必清洁、干燥，采集水样时，瓶内应充满水样不留空气.采样后，用塑胶带将瓶口密封.
b.毒性测定应在采样后6h内进行.否则应在2~5C下保存样品，但不得超过24h.报告中应写明水样采集时间和测定时间.
c.对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定.
5.2.1样品液测定前稀释的条件
CK管（氯化钠3g/100ml溶液），按6所述测定相对发光度.
5.2.1.2按5.2.1.1测得的样品，相对发光度低于50%乃至零，欲以EC表达结果，则须稀释.
5.2.1.3按5.2.1.1测得的样品，相对发光度在1%以上，欲以与相对发光度相当的氯化汞浓度表达结果，则不须稀释.
5.2.2样品液的稀释液
样品液的稀释液一律用蒸馏水，在定容前一律按构成氯化钠3g/100ml浓度添加氯化钠或浓溶液（母液只能加固体）.
5.2.3样品液稀释浓度的选择
5.2.3.1探测试验
按对数系列将样品液稀释成5个浓度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%（它们的对数依次为0，-1，
5.2.3.2试验
间，则应稀释成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%；若落在1%~10%之间，则 在1%~100%相对发光度所落在的浓度范围内再增配6~9个浓度（例如，若落在0.1%~10%之应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%），按6所述再测一遍；这6~9个浓度，也可通过查对数表，按等对数间距原则自行确定（例如，若落在1%~10%之间，则应稀释成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%，它们的对数相应为1.00、0.80、0.60、0.400.20、0.00，对数间距均为0.2）.
6测定
6.1测定条件
6.1.1室温
室温20~25℃.
于控温的测试室内. 同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过士1C，且测试器Ⅲ及试剂、溶液测前1h均置
6.1.2 pH
若须测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节水样pH.
要含Cu水样为4.5.主要含其他金属水样为5.4，主要含有机化合物水样为7.0. 若须测定排除pH影响在内的急性毒性，须将水样和CK（氯化钠3g/100ml）pH测前调至下值：主
6.1.3溶解氧
本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性.
6.2测定步骤
6.2.1试管的排列
于塑料或铁制试管架上按以下二种情况排列测试管.
6.2.1.1按5.2.1.3所述，样品母液相对发光度为1%以上者，如下排列：
左侧放参比毒物氯化汞系列浓度溶液管，右侧放样品管.前排放氯化汞溶液和样品管，后一排放对照（CK）管，后二排放CK预试验管.每管氯化汞或样品液均配一管CK（氯化钠3g/100ml蒸馏水溶液）.设3次重复，每测一批样品，均须同时配置测定系列浓度氯化汞标准溶液.
表2试管在试管架上的排列
后二排 CK：CK后一排 CK CK CKCKCKCKCKCKCKCKCKCKCKCK前排0.020.020.020.040.040.040.24样1样1样1样2样2祥2祥管群 氯化汞（mg/L） 样品
6.2.1.2按5.2.1.2所述，样品母液相对发光度为50%以下乃至零者，如下排列：
15min的相对发光度应在50%左右），右侧放样品稀释液管（从低浓度到高浓度依次排列）.其他同 左侧仅放氯化录0.10mg/L溶液管（作为检验发光细菌活性是否正常的参考毒物浓度，它反应6.2.1.1.每测一批样品，均须同时配测氯化汞0.10mg/L溶液.
6.2.2加3g/100ml氯化钠溶液
用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2或5ml氯化钠3g/100ml（据仪器型号而定）.
用2或5ml吸管给每支样品管加2或5ml样品液（据6.2.2面定）.每个样品号换一支吸管.
从冰箱2~5℃室取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓶和氯化钠溶液，投人置有冰块的小号（1~1.5 L）保温瓶，用1ml注射器吸取0.5ml冷的氧化钠2g/100ml（适用于5ml测试管）或1ml冷的氧化钠2.5%（适用于2ml测试管）注入已开口的冻干粉安瓶，务必充分混匀.2min后菌即复苏发 光（可在暗室内检验，肉眼应见微光）.备用.
6.2.5仅器的预热和调零
打开生物发光光度计电源，预热15min，调零，备用.
6.2.6仅器检验复苏发光细菌冻干粉质量
液，盖上瓶塞，用手颠倒5次以达均匀.拔去瓶塞，将该管放入各自型号仅器测试舱内，若发光量立即显 另取一空2或5ml测试管，加2或5ml氯化钠3g/100ml（据6.2.2面定），加10pl复苏发光菌先缓慢上升，约持续5~15min，后缓慢下降，约持续4h.满4h的CK发光量应不低于400mV，低于者更换冻干粉.
6.2.7给各测试管加复苏菌液
在发光菌液复苏稳定（约半小时）后，按6.2所述，从左到右，按氯化汞或样品管（前）一CK管（后）氯化汞或样品管（前）~CK管（后）顺序，用10微量注射器（勿用定量加液器以减少误差）准确吸取10pl复苏菌液，逐一加入各管，盖上瓶塞，用手颠倒5次，拔去瓶塞，放回原位（每管加菌液间隔时间勿短于30s.每管在加菌液的当时务必精确计时，记录到秒，即为样品与发光菌反应起始时间，立即将此时间加15min，记作各管反应终止（也即应该读发光量）的时间.
6.2.8发光细菌与样品反应达到终止时间的读数
按各管原来加菌液的先后顺序，当某管达到记录的反应终止时间，在不加瓶塞的情况下，立即将测试管放入仅器测试舱，读出其发光量（以光信号转化的电信号---电压mV数表示）.
6.2.9有色样品测定干扰的校正
a.拿掉仅器样品舱上的黑色塑料管口；
b.取一2ml测试管（直径12mm），加氯化钠3g/100ml溶液2ml，将该管放进一装有少量氧化钠3g/100ml溶液的5ml管（直径20mm）内，要使外管与内管的氯化钠3g/100ml液面平齐，此作CK管：
5ml管内，要使外管与内管的氯化钠3g/100ml液面平齐.此作CKc管： c.另取一2ml测试管，加氯化钠3g/100ml溶液2ml，放入另一装有少量有色待测样品液的
d.于CK和CKc二管的内管中同时加复苏发光菌液10pl（注意：必须是本批样品测定所用同一瓶复苏菌液），立即记时到秒，等反应满15min，迅即放入仪器测试舱，测定二只带有内管的5ml测试管的发光量.分别记下发光量L（CK管）和L（CKc管）：
e.计算因颜色引起的发光量（mV）校正值△L=L一L：
f.接6.2.7和6.2.8所述常规步骤测试带色样品管及其CK管（氯化3g/100ml溶液）的发光量（mV）.CK管测得之发光量（mV）均须减去校正值△L（mV）后才能作为CK发光量（mV）.
