中华人民共和国国家标准
GB/T 15670.20-2017
农药登记毒理学试验方法 第20部分：体外哺乳动物细胞基因 突变试验
Toxicological test methods for pesticides registration-Part 20:In vitro mammalian cell gene mutation test
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则：第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法： 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法：；第5部分：急性经皮毒性试验；一第6部分：急性吸人毒性试验：第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： -第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验：第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验：第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验； 第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；一第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；-第23部分：致畸试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第20部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江.
农药登记毒理学试验方法 第20部分：体外哺乳动物细胞基因 突变试验
1范围
GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞基因突变试验的基本原则、方法和要求.本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T15670.14-2017农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
野生型基因经过突变成为突变型基因的过程，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变.
3.2碱基置换型致突变物basepair substitution mutagens引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质.
3.3移码型致突变物frameshiftmutagens引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质.
表型表达时间phenotypic expression time
新突变的细胞耗尽改变的基因产物所需的时间.
4试验目的
缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性. 本试验用于检测受试物对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，包括碱基对突变、移码突变和
5试验概述
本试验属正向突变试验，可检出碱基置换型致突变物和移码型致突变物.在加人和不加人代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞传代培养.胸苷激酶水平正常的细胞对三 氯胸苷（trifluorothymidine，TFT）等敏感，因而在培养液中不能生长分裂，突变细胞则不敏感，在含有三氟胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落.相似的，次黄標呤乌原呤磷酸核糖基酶（HPRT）正常的细胞对6-硫代乌嘌呤（6-thioguanine 6-TG）敏感，突变的细胞则不敏感，在含有6-硫代乌嘌呤的选择性培养液中可生长形成集落.基于突变集落数，计算突变類率以评价受试物的致突变性.
6试验方法
6.1受试物和试剂
6.1.1受试物
6.1.1.1受试物的配制
固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统或用前稀释至适合浓度.受试物应在使用前新鲜配制，否则应证实贮存不影响其稳定性.
6.1.1.2溶剂的选择
溶性溶剂.二甲基亚纲（DMSO)也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于0.5%. 溶剂应是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性.首选溶剂是水或水
6.1.1.3受试物浓度设置
6.1.1.3.1最高浓度的选择
决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压（osmolality）的改变.
6.1.1.3.2细胞毒性的确定
应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（totalgrowth）.应在预试验中确定细胞毒性和溶解度.
6.1.1.3.3剂量设置
至少应设置4个可供分析的浓度.当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至儿乎无毒性，通常浓度间隔系数在2~√10之间.
如最高浓度是基于细胞毒性，则该浓度组的细胞相对存活率（相对集落形成率）或相对细胞总生长情况应为10%~20%（不低于10%）
对于细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5pL/mL，5mg/mL或0.01mol/L.
对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值.最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化.不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察.
6.1.2对照
6.1.2.1一般原则
在每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性（溶剂）对照.
6.1.2.2阳性对照
当使用代谢活化系统时，阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质，在没有代谢活化（methylmethanesulfonate，MMS，TK试验）、乙基亚硝基脲（ethyl nitrosourea，ENU，HPRT试验）等. 系统时，阳性对照物可使用甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS，HPRT试验）、甲磺酸甲酯在有代谢活化系统时，可以使用3-甲基胆蕙（3-methylcholanthrene，HPRT试验，TK试验）、环磷酰胺（cyclophosphamideTK试验）、N-亚硝基胍（N-nitroso-dimethylamine，HPRT试验）、7 12-二甲基苯蕙（HPRT试验）等.也可使用其他适宜的阳性对照物.
6.1.2.3阴性对照
阴性对照（溶剂对照）除不含受试物外，其他处理应与受试物组相同.当不具有实验室历史资料证实所用溶剂无致突变作用和无其他有害作用时，应增设空白对照.
6.1.3细胞
变分析宜用小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6），细胞在使用前应进行有无支原 HPRT位点突变分析宜用中国仓鼠肺细胞株（V-79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO）.TK位点突体污染的检查.
6.1.4培养液
（Eagle）培养液加人10%胎牛血清和适量抗菌素.对于15178Y或TK6细胞，常用RPM11640培养液 应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养液，对于V-79或CHO细胞，常用MEM加人10%马血清和适量抗菌素.
6.1.5活化系统
通常使用的是S9混合物（S9mix）.S9是从经酶诱导剂处理的晒齿动物肝脏获得的.S9的制备见GB/T15670.14-2017的5.7.S9的使用浓度为1%~10%（终浓度）.S9mix中所加辅助因子的量 由各实验室自行决定，但需对S9rmix的活性进行鉴定，应能明显活化阳性对照物.也可使用下述配方：
S9 0.125 mLMgCl; (0 4 mol/L) 0.02 mLKC1(1.65 mol/L) 1.791 mg 0 02 mL葡萄糖-6-磷酸 辅酶Ⅱ（氧化型，NADP) 3 061 5 mg用无血清MEM培养液补足至1ml.
6.1.6选择剂
6-硫代鸟嘌岭（6-TG）宜使用终浓度5μg/mL~10μg/mL.三氟胸苷（TFT）宜使用终浓度3 μg/mL.
