中华人民共和国国家标准
GB/T17813-2018 代替GB/T17813-1999
Determination of nicotinic acid and folic acid in premixHigh performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准代替GB/T17813-1999《复合预混料中烟酸、叶酸的测定高效液相色谱法》.本标准与GB/T17813-1999相比，除编辑性修改外，主要技术内容修改如下：
"修改了方法的检测限，增加了定量限（见第1章，1999年版的第1章）； 修改了标准名称：修改了爆酸、叶酸测定原理（见第3章和第4章，1999年版的第3章）；一修改了烟酸和叶酸的提取液组成（见第3章和第4章，1999年版的4.6）：一修改了烟酸标准溶液的配制方法（见3.2.9，1999年版的4.5.1）： 修改了烟酸和叶酸流动相与色谱条件（见3.2.7、3.5.2和4.5.2，1999年版的7.2.1.1）；一复合预混合饲料提取方法中，增加了二水合乙二胺四乙酸二钠（EDTA）使用（见3.5.1.2和4.5.1.2，1999 年版的 7.1);
增加了烟酸、叶酸的标准色谱图（见附录A）.
本标准由全国何料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口.
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心（北京）].
本标准主要起草人：李兰、贾静、索德成.
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
GB/T 17813-1999.
添加剂预混合饲料中烟酸与叶酸的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了添加剂预混合饲料中烟酸、叶酸含量测定的高效液相色谱法.本标准适用于维生素预混合何料及复合预混合饲料中烟酸、叶酸的测定.烟酸的检测限为100mg/kg，定量限为300mg/kg;叶酸的检测限为15 mg/kg，定量限为 50 mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3烟酸的测定
3.1原理
试样中烟酸用酸性甲醇水溶液提取，采用高效液相色谱仪分离，紫外检测，外标法定量.
3.2试剂或溶液
3.2.1冰乙酸：优级纯. 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中一级水的规定.3.2.2庚烷磺酸钠：色谱纯.3.2.3三乙胺：优级纯.3.2.4甲醇：色谱纯.3.2.6提取液：称取50mg二水合乙二胺四乙酸二钠（以下简称EDTA）溶于约800mL水中，加人 3.2.50.1%三氟乙酸溶液：移取1mL三氟乙酸于1000mL水中.3.2.7流动相：称取1.1g庚烷磺酸钠（3.2.2）、50mgEDTA溶于约1000mL水中，加人20mL冰乙酸（3.2.1）、5mL三乙胺（3.2.3），混匀，用冰乙酸、三乙胺调节溶液pH值为4.0，过0.45μm滤膜.取上述溶液800mL与200mL甲醇（3.2.4）混合，备用. 3.2.8烟酸标准品：烟酸含量≥98.0%.量瓶中，加水使其溶解，并加人1mL0.1%三氟乙酸溶液（3.2.5），用水定容至刻度，摇匀.该标准储备液中烟酸含量约为1mg/mL，2C~8℃保存，有效期为6个月.3.2.10烟酸标准工作液：根据试样种类（维生素预混合饲料、复合预混合饲料）调整稀释倍数，使标准
GB/T 17813-2018
工作液浓度在10μg/mL~150μg/mL，用提取液（3.2.6）稀释定容.当日制备并使用.
3.3仪器设备
3.3.1天平：感量0.0001g、感量0.001g.3.3.2离心机：转速不低于8000r/min（相对离心力不低于6010g）. 3.3.3超声波水浴.3.3.4高效液相色谱仅：配紫外可调波长检测器（或二极管矩阵检测器）.
3.4样品
碎过0.425mm孔径筛，充分混匀，储存在密闭容器中，避光保存. 按照GB/T14699.1抽取有代表性的何料样品，用四分法缩减取样，按GB/T20195制备试样，粉
3.5试验步骤
3.5.1试样的提取
3.5.1.1维生素预混合饲料的提取
称取试样0.5g（精确到0.001g），置于100mL棕色容量瓶中，加人提取液（3.2.6）约70mL，边加边摇匀后置于超声水浴中超声提取15min，期间摇动2次，待冷却后用提取液（3.2.6）定容至刻度，摇匀.取约25mL上述溶液于离心机8000r/min离心5min，取上清液用提取液（3.2.6）稀释10倍后过 0.45μm微孔滤膜，上机测定.
3.5.1.2复合预混合饲料的提取
称取试样约1g（精确到0.001g），置于100mL棕色容量瓶中，加人1gEDTA钠盐，边摇动边加人提取液（3.2.6）约70mL，置于超声水浴中超声提取15min，期间摇动2次，待冷却后用提取液（3.2.6）定 容至刻度，摇匀.取适量溶液于离心机8000r/min离心5min或过滤，取上清液过0.45pm微孔滤膜，上机测定.
3.5.2参考色谱条件
流动相：见3.2.7. 色谱柱：C柱，长250mm内径4.6mm，粒径5μm或性能相当者.流速：1.0 mL/min.温度：室温.检测波长：262nm 进样量：20μL
3.5.3测定
取烟酸标准工作液（3.2.10）和试样溶液（3.5.1）分别进样，得到色谱峰面积响应值，在线性范围内，用外标法单点校正，测定，以保留时间定性，峰面积定量.烟酸标准色谱图参见附录A中图A.1.
3.6试验数据处理
试样中烟酸的含量，以质量分数u计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1)计算：
式中：
P试样溶液峰面积值；V 试样稀释体积，单位为毫升（mL）；C 烟酸标准溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V-试样溶液进样体积，单位为微升（pL）： V.烟酸标准溶液进样体积，单位为微升（pL）；P-烟酸标准溶液峰面积平均值；m-试样质量，单位为克（g）；测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字.
3.7精密度
对于烟酸含量小于或等于500mg/kg的添加剂预混合饲料，在重复性条件下获得的两次独立测定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%.
其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%. 对于烟酸含量大于500mg/kg的添加剂预混合饲料，在重复性条件下获得的两次独立测定结果与
4叶酸的测定
4.1原理
试样中叶酸用弱碱液提取，采用高效液相色诺仪分离检测，紫外检测，外标法定量.
4.2试剂或溶液
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中一级水的规定.4.2.10.1mol/L碳酸钠溶液：称取5.3g无水碳酸钠溶解于500mL水中.4.2.22mol/L碳酸钠溶液：称取106g无水碳酸钠，溶解于500mL水中.4.2.4复合预混料提取液：饱和EDTA溶液2mol/L碳酸钠溶液溶液=8025，pH=9.4.2.6叶酸标准储备溶液：准确称取0.05g（精确到0.0001g）叶酸标准品（4.2.5），置于100mL棕色容 4.2.5叶酸标准品：叶酸含量≥95.0%.量瓶中，加人0.1mol/L碳酸钠溶液（4.2.1），超声使其溶解，稀释定容至刻度，摇匀.该标准储备液中叶酸含量为500μg/mL，2℃~8℃保存，有效期6个月.4.2.7叶酸标准工作液：根据样品种类（维生素预混合饲料、复合预混合饲料）调整稀释倍数，使标准工作液中叶酸浓度约为5.0μg/mL~10.0μg/mL，用0.1mol/L碳酸钠溶液（4.2.1）稀释定容.当日制备并使用.
4.3仪器设备
同3.3
4.4样品
同3.4.
