中华人民共和国国家标准
GB/T 18932.27-2005
蜂蜜中泰乐菌素残留量测定方法 酶联免疫法
Method for the determination of tylosin residue in honeyEnzyme-linked immunosorbent assay method
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
GB/T18932本部分的附录A为资料性附录.本部分由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本部分由中华全国供销合作总社归口.本部分起草单位：中华人民共和国泰皇岛出入境检验检疫局.本部分主要起草人：庞国芳、付宝莲、张进杰、肖艳藏.本部分系首次发布的国家标准.
蜂蜜中泰乐菌素残留量测定方法 酶联免疫法
1范围
GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中泰乐菌素残留量酶联免疫测定方法.本部分适用于蜂蜜中泰乐菌素残留量的测定.本部分的方法检出限：泰乐菌素为10.0jg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分.
GB/T6379测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性(GB/T neq ISO 5725 : 1981)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，negISO3696：1987）
3原理
试样中残留的泰乐菌素与试剂盒中的泰乐菌素酶标记物共同竞争泰乐菌素抗体，形成的酶标记抗原抗体复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中泰乐菌素的含量.
4试剂和材料
4.1泰乐菌素试剂盒：4.1.196孔板：12条×8孔.4.1.2泰乐菌素标准溶液.4.1.4泰乐菌素酶标记物. 4.1.3标准和样品缓冲溶液：浓缩液.4.1.5酶标记物缓冲溶液.4.1.6洗板溶液：浓缩液，4.1.7显色剂.4.2缓冲溶液：将标准和样品缓冲溶液（4.1.3）按泰乐菌素试剂盒（4.1）中规定的比例用水稀释，混匀 4.1.8反应停止液.后备用.4.3泰乐菌素标准工作溶液：根据泰乐菌素试剂盒的线性范围，用稀释的缓冲溶液（4.2）将泰乐菌素标准溶液（4.1.2）稀释成不同浓度（μg/L）的标准工作溶液.每次测定均应现配现用.4.4泰乐菌素酶标记物溶液：根据泰乐菌素试剂盒中说明，用酶标记物缓冲溶液（4.1.5）将泰乐菌素酶4.5洗板工作溶液：将洗板溶液（4.1.6）按泰乐菌素试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用. 标记物（4.1.4）溶解，混匀后备用.4.6水：GB/T6682规定的一级水.
5仪器
5.1酶标仪. 5.28道移液器：50pL~300uL5.3单道移液器：5μL~50μL 100μL~1 000L 和 2 mL~10 mL.5.4液体混匀器.5.5离心机.5.6注射过滤器：2mL，并带有孔径为0.45um的水相针头式过滤膜. 5.7具塞试管：10mL 20ml.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
60C的水浴中温热、振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温，分出0.5kg作为试样.制备好的试样 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀.对有结晶的实验室样品，在密闭的情况下，置于不超过置于样品瓶中，密封，并加以标识.
6.2试样的保存
将样品于室温下保存.
7分析步骤
7.1提取
称取1g试样，精确到0.01g，置于20mL具塞试管中，加人9mL缓冲溶液（4.2）于液体混匀器上快速混匀1min，使试样完全溶解，以3000r/min离心10min后，取适量的样品上清溶液用注射过滤器 过滤至10mL的具塞试管中，供酶标仪测定.此溶液稀释系数为10.
7.2测定条件
以下操作应在20C~24C室温下进行.7.2.1酶标仅测定条件：酵标仪测定波长为450nm.7.2.2人工洗板条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250uL. 7.2.3泰乐菌素试剂盒中试剂的温度均应回升至室温（20C～24C）后方可使用.7.2.4将测定需用的微孔板（4.1.1）备齐并插人微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置（模板图）
7.3测定
测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头.孔底部.7.3.2分别吸取100μL泰乐菌素酶标记物溶液（4.4）于每一个微孔底部，然后，用封口膜密封孔口以防溶液挥发.持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20C～24C避光孵育10min. 7.3.3倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干燥，然后，立即用洗板工作溶液（4.5）按7.2.2要求进行洗板，每次弃去洗板溶液后，均应将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干燥.7.3.4迅速加入100gL显色剂（4.1.7）于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式7.3.5迅速加人100μL反应停止液（4.1.8）于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动 混匀后，于20C~24C避光孵育10min方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在450nm处测量吸光度（加人反应停止液后应在60min内读取
2
吸光度）.
7.4平行试验
按以上步骤，对同一标准、同一样品溶液均应进行平行试验测定.
7.5空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤进行.
7.6监控试验
每次测定均应做一个添加泰乐菌素标准的显色剂样品.
8结果计算
在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标（%），泰乐菌素标准工作溶液浓度（pg/L）为横坐标，绘制标准工作曲线.从标准工作曲线上得到试样中相应的泰乐菌素浓度后，结果按公式（1）计算：
式中：
X-试样中泰乐菌素残留量，单位为微克每千克（pg/kg）；V样品溶液的体积，单位为毫升（mL）： -从标准工作曲线上得到的试样中泰乐菌素浓度，单位为微克每升（μg/L）；m样品溶液所含的试样质量，单位为克（g）.结果表示到小数点后两位.
注：计算结果应扣障空白值.
9确证试验
如被测样品中泰乐菌素残留量的值大于检出限时，应用LC-MS-MS法进行确证.
10精密度
本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算，
10.1重复性
在重复性条件下，蜂蜜中泰乐菌素的含量在10.0μg/kg~100.0μg/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限（r），本部分的重复性限按方程式（2）计算：
式中：
m--两次测定值的平均值，单位为微克每千克（μg/kg）.
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定.
10.2再现性
在再现性条件下，蜂蜜中泰乐菌素的含量在10.0yg/kg~100.0μg/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性（R），本部分的再现性限按方程式（3）计算：
式中：
m两次测定值的平均值，单位为微克每千克（μg/kg）.
