中华人民共和国国家标准
GB/T 19427-2022代替GB/T19427-2003
蜂胶中12种酚类化合物含量的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法
Determination of 12 phenolic pounds in propolisHPLC-MS/MSmethodandHPLCmethod
国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本文件按照GB/T1.1一2020（标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
姜素含量的测定方法液相色谱-串联质谱检测法和液相色谱-紫外检测法》，与GB/T19427-2003相 本文件代替GB/T19427-2003（蜂胶中芦丁、杨梅酮、棚皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良比，除结构调整和编辑性修改外，主要技术变化如下：
a）增加了咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C检测项目（见第1章、5.11、7.2)：b）删除了芦丁、杨梅酮检测项目（见2003年版的第1章，4.4、4.5、4.6、6.2）： c）更改了蜂胶样品提取条件（见7.1，2003年版的6.1）.
本文件由中华全国供销合作总社提出.
本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口.
本文件起草单位：秦皇岛海关技术中心、浙江大学、厦门思健生物科技有限公司.
曹彦忠、颜鉴翔. 本文件主要起草人：李学民、胡福良、崔宗岩、张翠平、李响、杨志伟、曹翠玲、刘晓茂、贾光群、张进杰、
本文件所代替文件的历次版本发布情况为：
GB/T 19427-2003
蜂胶中12种酚类化合物含量的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法
1范围
本文件描述了蜂胶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、皮素、菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C含量测定的液相色谱-串联质谱法和液相色谱法.
本文件适用于蜂胶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、皮素、茨非醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C含量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义，
4原理
蜂胶试样用85%乙醇水溶液提取，超声、离心、过滤和定容后，液相色谱-串联质谱仪测定或配有紫外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量.
5试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
5.1乙醇：无水乙醇. 5.2甲醇：色谱纯.5.3甲酸：色谱纯.5.5乙醇水溶液（8515）：准确移取85mL乙醇（5.1）至100mL容量瓶中，用水定容.5.7甲醇-0.1%甲酸水溶液（5050）：准确移取50mL甲醇（5.2）以及0.1mL甲酸（5.3）至100mL容 5.6甲醇水溶液（8020）：准确移取80mL甲醇（5.2）至100mL容量瓶中，用水定容.量瓶中，用水定容.01（）由0由%85.101.0%乙酸水溶液：准确移取10ml乙酸（5.4）至1000mL容量瓶中，用水定容. （2）由中000（）由01由-硬由%069
5.4乙酸：色谱纯.
GB/T 19427-2022
5.11标准物质：绿原酸（CAS号：327-97-9）、咖啡酸（CAS号：331-39-5）、p-香豆酸（CAS号：501-98-4）、阿魏酸（CAS号：1135-24-6）、皮素（CAS号：117-39-5）、菲醇（CAS号：520-18-3）、芹菜素（CAS号：520-36-5)、松属素（CAS号：480-39-7)、短叶松素3-乙酸酯（CAS号：52117-69-8）.柯因（CAS号：480-40-0)、高良姜素（CAS号：548-83-4）和阿替匹林C（CAS号：72944-19-5），纯度均不低于98%.
5.12标准储备液：准确称取适量的标准物质（5.11)，分别用甲醇（5.2）制备浓度为1.0mg/mL的标准 储备液，该储备液在一18℃及以下温度可稳定保存6个月.
5.13标准工作溶液：移取适量的标准储备液（5.12），用甲醇-0.1%甲酸水溶液（5.7）稀释成浓度为0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL 0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL的混合标准工作溶液，供液1.0μg/mL、2.0 μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL 20.0 μg/mL、50.0 μg/mL 的混合标准工作溶液，供液 相色谱-串联质谱法检测使用；移取适量的标准储备液（5.12），用甲醇水溶液（5.6）分别稀释成浓度为相色谱-紫外检测法检测使用.
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源.6.2液相色谱仪：配有紫外（或二极管阵列）检测器.6.3分析天平：感量0.01mg和0.001g.6.4超声波清洗仪. 6.5离心机：转速不低于4000r/min6.6微量可调移液器：量程分别为10μL~100pL和0.1mL~1mL.6.7微孔滤膜：0.22ym
7分析步骤
7.1试样的制备与处理
7.1.1试样的制备
取混合均匀的代表性蜂胶样品约100g，密封，并做标记.在样品测定前，将被测样品放人10C以下冰箱中保持2h后，取出20g~30g，迅速用粉碎机粉碎，过孔径约为2mm（10目）的筛，冷藏保存于冰箱中作为待测试样.
7.1.2试样的处理
称取0.5g（精确至0.001g）试样于50mL塑料离心管中，加15mL乙醇水溶液（5.5），在室湿超声提取20min，在4000r/min下离心10min，上清液转入50mL容量瓶中，按照上述步骤重复提取离心2次，合并上清液，用乙醇水溶液（5.5）定容至50mL，混匀.取上述样品溶液用甲醇水溶液（5.6）适当稀释并混匀后，取部分溶液过0.22um微孔滤膜（6.7）至样品瓶中，供液相色谱仪（6.2）测定：或取上述样 品溶液用甲醇-0.1%甲酸水溶液（5.7）适当稀释后，过0.22μm微孔滤膜（6.7）至样品瓶中，供液相色谱-中联质谱仪（6.1）测定.
7.2测定
7.2.1液相色谱-串联质谱参考条件
a）色谱柱：C18，100mm×2.1mm；1.7μm或相当者：
b）流动相A：0.1%甲酸水溶液（5.8）；c）流动相B：0.1%甲酸-甲醇溶液（5.9），梯度洗脱条件参见附录A的表A.1：d）流速：0.25mL/min;e）柱温：30℃；液相色谱-串联质谱仪的质谱参考条件如下： 进样体积：2pL.a）扫描方式：正负离子扫描；b）检测方式：多离子反应监测（MRM）；雾化气体气压：0.345MPa； 电喷雾电压：5500V/-4500V；e) 气帘气压：0.172MPa;f) 离子源温度：500C：去簇电压：100V/-100V；h）定量离子对、定性离子对和碰撞能量：参见表1.
7.2.2液相色谱参考条件
液相色谱仪（6.2）的参考条件如下：
a）色谱柱：C18，150mm×4.6mm;3.0μm或相当者；b) c) 流动相A：1.0%乙酸水溶液（5.10）； 流动相B：甲醇（5.2），梯度洗脱条件参见表A.2；d） 流速：1.0mL/min;e) 柱温：35℃C：f) 进样体积：5pL；g) 检测波长：12种酚类化合物的定量检测波长参见表1.
表1 HPLC-MS/MS离子化模式、定量离子对、定性离子对、碰撞能量及HPLC-UV检测波长
离子化模式 定量离子对 定性离子对 硬能量/V HPLC-UV检测波长/化合物 (m/≥1 (m/≥1 nm绿原酸 负离子（-） 352.9/190.9 352.9/85 0 20/52 310咖啡酸 负离子（-) 178 8/134 9 178 8/133 9 20/32 310p-香豆酸 负离子（-) 162.8/118.9 192 8/177 9 162.8/92 9 20/40 310阿魏酸 郴皮素 负离子（-） 负离子（-） 5°0s1/8008 5*81/8261 300 8/178.8 22/18 28/24 310 350获非醇 正离子（） 287 0/153 0 287 0/68.9 41/79 350芹菜素 负离子（一） 268.9/116.9 268 9/150.9 38/32 350松属素 正离子() 257 0/153 0 257 0/131 0 35/40 280短叶松素3-乙酸酯 负离子（-） 312.7/253 0 312 7/271.0 28/26 280柯因 正再子（) 255 0/153 0 255 0/77 0 45/83 280高良姜素 正离子（） 271.0/153.0 271 0/77 0 41/73 280阿替匹林C 负离子（） 299 0/255 0 299 0/200 0 24/28 315
