中华人民共和国国家标准
GB/T 19915.4-2005
猪链球菌2型三重PCR检测方法
Method of detecting Streptococcus suis type 2 by triple-PCR
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等.人可通过伤口感染该菌，并导致死亡.为了区别正常猪所携带的猪链球菌2型无毒菌株与发病猪分离的致病 菌株，特制定本标准，本标准是采用现代分子生物学诊断技术制定的.
本标准由农业部畜牧兽医局提出.
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口.
本标准起草单位：南京农业大学.
本标准主要起草人：陆承平、姚火春、范红结、何孔旺.
猪链球菌2型三重PCR检测方法
1范围
本标准规定了猪链球菌2型荚膜基因（cpx2）、溶菌酶释放蛋白基因（mrp）和orf2这三个毒力基因的三重PCR检测技术.
本标准适用于由猪链球菌2型致病基因和致病菌株的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
猪链球菌2型Streptococcus suis type 2
猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1~34及1/2共35个血清型，猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，面且可以感染特定的人群，是 一种重要的人畜共患病病原菌.
4测定方法
4.1方法提要
与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小. 挑取可疑细菌培养物菌落，加人PCR反应管中，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，
4.2试剂和材料
除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682一1992的灭菌双蒸水.4.2.1cpx2、mrp和orf2的上下游引物，按合成说明书使用. 4.2.2TaqDNA聚合酶.4.2.3琼脂糖：电泳级.4.2.4澳化乙锭.4.2.5分子量标记：DL-2000.4. 2. 6 TE 缓液 : 10 mmol/L Tris-HCI( pH 8 0) 1 mmol/ L EDTA(pH 8. 0) 4. 2. 7 10 × PCR 缓冲液 :10 mmol/ L KC1 160 mmol/L(NH )SO 20 mmol/L MgSO 200 mmol/ LTris-HCI( pH 8. 8) 1% TritonX-100 1 mg/mL BSA.4.2.8电泳缓冲液：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水至1000mL，使用时10倍稀释.4.2.9加样缓冲液：0.25%澳酚蓝，40%蔗糖. 4.2.10阳性对照猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板，阴性对照马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板.
GB/T 19915.4-2005
4.2.11猪链球菌2型三重PCR反应混合物.
4.3仪器和设备
4.3.1离心机.4.3.3核酸电泳仪.4.3.4pH计.4.3.5移液器：10μL、20 pL、100μL、1 000pl4.3.7恒温水浴锅. 4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统.4.4PCR操作步骤
4.3.2DNA热循环仪.
4.4.1阳性对照和阴性对照DNA模板的提取
分别将猪链球菌2型HA9801、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株接种于5%牛血清Todd-Hweitt肉汤培养基，37C摇振培养18h，用革兰氏阳性细菌柱离心 式基因组DNA小量抽提试剂盒提取DNA模板，-20C保存备用.
4.4.2PCR扩增
用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重PCR反应混合物的PCR管中，混匀，加人Taq酶（2U/uL）0.7L2000r/min离心10s，立即进行PCR扩增：同时设去离子水的空白 对照、猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板的阳性对照、马链球菌兽疫亚种ATCC35246和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照.扩增条件为：94C预变性5min；94C30s，55C30s，72C40s，30个循环；72C延伸7min，4C保存.
4.4.3琼脂糖凝胶电泳
产物加人2pL5×上样缓冲液，混匀后加人上样孔，80V恒压电泳20min，紫外线透射检测. 在电泳缓冲液中加人1%琼脂糖，加热融化后加人澳化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳.8uL酶切
5结果及判断
5.1试验结果成立条件
照、马链球菌兽疫亚种ATCC35246和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照 阳性对照HA9801株经PCR扩增出现约858bp、387bp和316bp三条条带，去离子水的空白对PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立，否则，结果不成立，
5.2结果判断
387bp一条条带，可判定为猪链球菌2型；待检样品出现约387bp、316bp和858bp三条条带，或出现 琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线投射下检测，在空白和阴、阳性对照成立的情况下，待检样品只出现387bp和858bp两条条带，可判定为猪链球菌2型致病菌株：待检样品只出现858bp一条条带，可判定为非猪链球菌2型的致病菌；待检样品不出现条带，结果为阴性.
6废弃物处理和防止污染的措施
检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理.
