中华人民共和国国家标准
GB/T19915.5-2005
Protocol of multiplex PCRidentification of Streptococcus suis type 2
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A为规范性附录.本标准由国家标准化管理委员会提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口.本标准由中国检验检疫科学研究院负责起草本标准主要起草人：韩雪清、林祥梅、吴绍强、刘建、贾广乐、梅琳、陈国强、张敬友、姜焱、唐泰山.本标准为首次发布.
猪链球菌2型多重PCR检测方法
1范围
本标准规定了猪链球菌2型多重PCR检测的操作方法.
猪源链球菌及猪链球菌2型. 本标准适用于检测生猪拭子、增菌培养物、疑似病料及猪组织样品（猪淋巴结、扁桃体、肉品等）中的
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法.
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
猪链球菌2型Streptococcus suis type2
猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1~34及1/2共35个血清型，猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，面且可以感染特定的人群，是 一种重要的人畜共患病病原菌，
3. 2
多重聚合酶链式反应（多重PCR）multiplexpolymerase chainreaction
多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系中加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片断的PCR反应.
4缩略语
本标准采用下列缩略语：DNA脱氧核糖核酸 PCR聚合酶链式反应dNTP脱氧核酸三磷酸bp碱基对
5试剂和材料
除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-1992的灭菌双蒸水或超纯水.
5.1猪链球菌2型多重PCR反应混合物
PCR缓冲液（含 Mg²），2μL;dNTP，1.6 L;引物1，0.6L；引物 2，0.6μL;引物3，0.6pL;引|物4 0.6μL;菌液1.5pL;酶0.2pL;水12.3yL;总体积20μL.
5.2Tag DNA聚合酶
100 mmol/L KCI 160 mmol/L (NH );SO 20 mmol/L MgSO 、 200 mmol/L Tris-HCI
GB/T 19915.5-2005
5.6澳化乙锭
5.7DNA分子量标准
5.9核酸电泳缓冲液
稀释. Tris碱242g，冰乙酸57.1mL 0.5mol/L EDTA100mL 加蒸馏水至1000mL 使用时10倍
0.25%溴酚蓝，40%蔗糖.
5.11样品对照
猪链球菌2型菌DNA提取物分别作为阳性对照，马链球菌兽疫亚种DNA提取物为阴性对照.
6仪器和设备
6.1台式冷冻高速离心机（>13000r/min）.6.2DNA热循环仪.6.3核酸电泳仪和水平电泳槽.6.5可调移液器一套：10zL、20pL、200gL和1 000L. 6.4凝胶成像系统（或紫外透射仪）.6.6恒温水浴箱.
7操作方法
7.1方法概要
取培养菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加人到扩增猪链球菌和猪链球菌2型的PCR反应混合液中，进行PCR扩增：或直接将待检细菌培养进行PCR扩增.最后通过琼脂糖凝胶电 泳检测PCR产物，与DNA标准分子量进行比较，来确定扩增产物的大小，在此基础上判定样品的检测结果.
7.2样品采集
在实验室生物安全柜中操作，将采集的组织样本剔除包膜和其他结缔组织，选取内部实质部分，冻存于一20C备用.
7.3组织样本DNA的制备
采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，按说明书进行操作.
7.4多重PCR扩增
将培养的细菌纯培养物样品（不经过离心）1.2uL、或者将制备的各样品DNA以及阳性和阴性对（含Mg），2μL=dNTP，1.6μL；引物1，0.6pL物2，0.6L；引物3，0.6zL;引物4，0.6μL;酶 照DNA各1.5pL分别加入到含有猪链球菌2型菌的PCR反应混合液的相应PCR反应管中[缓冲液0. 2 μL:加水至总体积 20 μL]，2 000 r/min 离心 10 s，加人 Taq 酶(5 U/gμL)0. 2 μzL，2 000 r/min 离心10s，采用DNA热循环仪立即进行PCR扩增.
PCR扩增条件：94C7min：94C30s60C30s 72C1min，40个循环：72C10min.扩增反应结
束后，取出放置于4C.
7.5多重PCR扩增产物的电泳检测
（0.5pg/mL），然后制成凝胶板.在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶.取5pL~10μL 称取2.0g琼脂糖加人100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化后加人适量的澳化乙锭PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔.9V/cm恒压下电泳30min~35min.将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录.
8结果判定
8.1试验结果成立条件
猪链球菌2型阳性对照的PCR产物，经电泳后在305bp和460bp位置同时出现特异性条带，同时阴性对照PCR产物电泳后没有任何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立.
8.2阳性判定
异性条带，判定为猪链球菌2型检测阳性；若305bp位置出现特异条带而460bp位置无特异条带，判 在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电泳后在305bp和460bp的位置上同时出现特定为猪源链球菌阳性，但不是2型菌.
8.3阴性判定
如果在305bp和460bp的位置上均未出现特异性条带，判定为猪链球菌检测阴性.
