中华人民共和国国家标准
GB/T19915.7-2005
猪链球菌2型荧光PCR检测方法
Method of thereal-time PCR for the detection of Streptococcus suis type 2
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录.本标准由国家标准化管理委员会提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口，本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国兽医药品监察所.本标准主要起草人：张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、乔彩霞、王甲正、杨承槐、吴丹、谷强.本标准系首次发布的国家标准.
猪链球菌2型荧光PCR检测方法
1范围
本标准规定了猪链球菌2型荧光PCR检测方法，本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪链球菌2型的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法
3缩略语
本标准采用下列缩略语：
荧光PCR 荧光聚合酶链反应 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环圈数DNA 脱氧核糖核酸Taq DNA 聚合酶PBS 磷酸盐缓冲生理盐水
4原理
采用TagMan方法，在比对猪链球菌2型荚膜抗原2J基因（cps2J）序列的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对.探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团团发出的荧光信号.PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R （用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仅器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时.Taq酶的53的外切核酸酶功能将探针降解.这样探针土的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收.随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系.
5猪链球菌2型荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理
猪链球菌2型荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1-2004中附录C.
6试剂和材料
6.1试剂
除另有说明，所用试剂均为分析纯.6.1.1无水乙醇：-20C预冷.6.1.30.01mol/LpH7.2的 PBS：配方见附录A，（121土2)C、15min高压灭菌冷却.
6.1.275%乙醇：用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制，一20C预冷.
GB/T 19915.7-2005
6.1.4猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒”：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B
6.2仪器设备
6.2.1高速台式冷冻离心机：最大转速13000r/min以上.6.2.2荧光PCR检测仪、计算机. 6.2.32C~8C冰箱和-20C冰箱.6. 2.4量移液器：0.5 μxL~10μL.5 pl~20 μzL，20 plL~200 yuL，200 yL~1 00 μl6.2.5组织匀浆器.6.2.6混匀器.
7样品的采集与前处理
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须截一次性手套.
7.1.1棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf 管. 7.1.2上述取样工具必须经（121土2）C、15min高压灭菌并烘干或经160C干烤2h.
7.2.2扁桃体、内脏或肌肉样品
用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研体中充分研磨，再加5.0mLPBS混匀，然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中，编号备用.
7.2.3血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf 管中，编号备用.
7.3存放与运送
应避免反复冻融（最多冻融3次）.采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室.
8操作方法
8.1样本核酸的提取
在样本处理区进行.
8.1.1提取方法1
8.1.1.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和，对每个管进行编号标记.
8.1.1.2每管加人1.0mL裂解液，然后分别加人待测样本、阴性对照和阳性对照各100pL，一份样本换用一个吸头：混勾器上震荡混匀5s.于4C~25C条件下，10000r/min离心10min.
8.1.1.3取与8.1.1.1中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加人500yL无水乙醇（-20C预冷），对每个管进行编号.吸取8.1.1.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液要充分吸取， 不要吸出底部沉淀，颠倒混匀.
8.1.1.4于4C~25C条件下，5000r/min离心5min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）.轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干.加人1.0mL
1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品.
75%乙醇，颠倒洗涤.
8.1.1.5于4C～25C条件下，5000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）.轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干.
8.1.1.64000r/min离心10s，将管壁上的残余液体用到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5s~15s.不宜过于干燥，以免DNA不溶.
8.1.1.7加人11μL无DNA酶的灭菌纯化水，轻轻混匀，溶解管壁上的DNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用.
8.1.2提取方法2
8.1.2.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记.
8.1.2.2每管加人100μLDNA提取液1.然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100xL，一份样本换用一个吸头，混匀器上震荡混匀5s，于4C~25C条件下，13000r/min离心10min.
~25C条件下，2000r/min离心10 s. 8.1.2.3尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10LDNA提取液2，混匀器上震荡混匀5s.于4C
8.1.2.4100C干浴或沸水浴10min；加人40gL无DNA酶的灭菌纯化水，13000r/min离心10min，上清即为提取的DNA，冰上保存备用.
8.1.3DNA提取后的处理要求
提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于-70C冰箱.
8.2扩增试剂准备与配制
在反应混合物配制区进行.
从试剂盒中取出猪链球菌2型荧光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s.使用15gLPCR反应液及0.3gLTaq酶.计算各试剂的使用量，加人一适当体积试管中，向每个PCR 设所需PCR数为n，其中为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和.每个测试反应体系需管中各分装15L，转移至样本处理区.
8.3加样
在样本处理区进行.在各设定的PCR管中分别加人8.1.1.7或者8.1.2.4中制备的DNA溶液10yL，使总体积达25yL.盖紧管盖后，500r/min离心30 s.
8.4荧光PCR反应
在检测区进行.将8.3中加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序.
反应参数设置：
一第一阶段，预变性92C3min：一第二阶段，92C5s 60C30s，45个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行.
9结果判定
9.1结果分析条件设定
读取检测结果.网值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整.
9.2质控标准
9.2.1阴性对照无C值并且无扩增曲线.9.2.2阳性对照的C值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线.9.2.3如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效.
