中华人民共和国国家标准
GB/T 20743-2006
Method for the determination of bacitracinresiduesin porcine liver kidney and muscle tissuesLC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、山东农业大学.本标准主要起草人：庞国芳、范春林、连玉品、李岩、郑军红、曹彦忠、张进杰、李学民、刘永明.本标准系首次发布的国家标准.
猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的液相色诺-串联质谱测定方法.本标准适用于猪肉、猪肝和猪肾中杆菌肽残留量的测定（本方法测定杆菌肽中主要成分杆菌肽A）.本标准的方法检出限：50.0yg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004 ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，neq ISO 3696:1987)
3原理
试样中杆菌肽残留用酸化的甲醇水匀浆提取，经双硫踪三氯甲烷溶液进行液液分配净化后，再经固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2三氯甲烷：色谱纯.4.3甲酸 4.4双硫踪：优级纯4.5杆菌肽标准物质：纯度≥92.0%.4.6甲醇水（11）：量取250mL甲醇（4.1）与250mL水混合.4.80.1%甲酸甲醇溶液：移取1mL甲酸于装有约800mL甲醇的11容量瓶中，用甲醇定容至刻度 4.70.3%甲酸溶液：移取3mL甲酸（4.3）于装有约800mL水的1L容量瓶中，用水定容至刻度并混匀.并混匀.4.90.0025%双硫腺三氯甲烷溶液：称取0.025g双硫棕（4.4）于装有约800mL三氯甲烷（4.2）的1L容量瓶中，用三氯甲烷定容至刻度并混匀.4.11杆菌肽标准储备溶液：准确称取适量的杆菌肽于50mL容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液配制成 水（11）的250mL分液漏斗中，振摇1min，静置分层，取下层溶液备用.
浓度为0.1mg/mL的标准储备溶液.储备液在2C～4C保存，可用3个月.
GB/T 20743-2006
4.12杆菌肽标准工作溶液：移取杆菌肽标准储备溶液1.0mL于10mL容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液定容，配制成浓度为10.0mg/L的标准工作溶液，在2C~4C保存，可用1周.4.13杆菌肽基质标准工作溶液；根据需要吸取适量的杆菌肽标准工作溶液，用空白样品提取液稀释成 适当浓度的基质标准工作溶液，当天配制.4.14OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg 3mL.使用前分别用3mL甲醇和3mL水预处理，并保持柱体湿润.
5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3高速组织接碎机：转速不低于10000r/min.5.5离心机：转速不低于4000r/min. 5.4振荡器.5.6离心管：10mL和60mL，具塞.5.7液器：50mL.5.8固相萃取真空装置.5.10微量注射器：25 yL，100 pL. 5.9氮气吹干仪.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
0.5kg作为试样，将制备好的试样密封，并做上标记. 猪肝脏、肾脏要去除脂肪和其他的非肝脏、肾脏组织，猪肉要去皮和骨头，将其搅碎拌匀，分出
6.2试样保存
将试样置于一18C条件下保存.
7测定步骤
7.1提取
称取10g试样（精确到0.01g）置于60mL离心管中，加人0.1mL甲酸和20mL甲醇水（11），于高速组织接碎机上匀浆提取1min，然后加人20mL经甲醇水（11）饱和的0.0025%双硫棕三氯甲烷溶液，于振荡器上刷烈振荡10min，以4000r/min离心10min，取上清液10mL于 50mL试管中，弃去其余上清液.
往上述双硫棕三氯甲烷溶液中加人30mL水，接碎残渣，置于振荡器上剧烈振荡10min，移取全部上清液于另一60mL离心管中.重复提取一次，合并上清液，混匀，以4000r/min离心10min，取上清液30mL与50mL试管中的提取液合并，混匀.
7.2净化
在预处理过的固相萃取柱顶部连接贮液器，移人上述试管中样液，待样液全部通过萃取柱后，加人2mL水，弃去全部流出液.然后，将固相萃取柱在50kPa~55kPa的负压下抽干1h，最后用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10mL试管中，洗脱液在35C水浴中用氮气吹干，用0.5mL甲醇重新溶解残渣，再加人0.5mL0.3%甲酸溶液，摇匀后，供液相色谱-申联质谱仅测定.
7.3测定
7.3.1液相色谱条件
a)色谱柱：InertsilODS-3，5.0μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；
b）液相色谱梯度洗脱条件见表1；c）柱温：40C；d）进样量：20gL.
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间/min 0 00 流速/（μL/min） 400 水（含0.3%甲酸/（%） 95 0 甲醇/（%） 5.05 00 400 50 0 50 020 00 400 50 0 50 025 00 20 10 400 95 0 5 0400 95 0 5 0
7.3.2质谱条件
a）离子源：电喷雾离子源；b) 扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测：d) 电喷雾电压：5500V；e) 雾化气压力：690kPa； 碰撞气压力：410kPa;g) 气帘气压力：410kPa；h) 辅助加热气压力：690kPa；i）离子源温度：700C；j）定性离子对、定量离子对和去电压（DP）、聚焦电压（FP）、碰撞气能量（CE）及碰撞室出口电 压（CXP）见表2.
表2杆菌肽的定性离子对、定量离子对、去簇电压、聚焦电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压
定性 定量 去族 聚焦 碰撞气 硅撞室名称 离子对 离子对 电压（DP）/ 电压（FP)/ 能量（CE)/ 出口电压(CXP)/（m/=1 （m/） v v V V73 3杆菌肽 712 3/356. 2 712 3/227. 2 712 3/199 2 52 90 48 743 3
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
纵坐标，绘制标准工作曲线.用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中杆菌肽的响应值均应在仪器 用5个不同浓度的杆菌肽基质标准工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为测定的线性范围内.在上述色谱条件下，杆菌肽的总离子流图参见图A.1.杆菌肽的保留时间为8 49 min.
本方法的添加回收率数据参见表B.1.
7.4平行试验
按上述步骤，对同一试样进行平行试验.
7.5空白试验
除不称取试样外，均按上述分析步骤进行.
