中华人民共和国国家标准
GB/T 20744-2006
蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of metronidazole ronidazole anddimetridazole residues in honeyLC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、山东农业大学.本标准主要起草人：庞国芳、刘永明、曹彦忠、范春林、张进杰、李学民、吴艳萍、李金、连玉晶、林忠.本标准系首次发布的国家标准.
蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑 液相色谱-串联质谱法 残留量的测定
1范围
本标准规定了蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑残留量的液相色谱-串联质谱测定方法.本标准适用于蜂蜜中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑残留量的测定.本标准的方法检出限：甲硝唑检出限为0.1μg/kg；洛确唑和二甲确咪唑检出限均为0.2pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992 negISO3696:1987)
3原理
串联质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙晴：色谱纯. 4.3乙酸乙酯：色谱纯.4.4甲酸：优级纯.4.5无水硫酸钠：分析纯.在650C马弗炉中灼烧6h，贮存于干燥器中.4.6洗脱剂：甲醇乙晴0.1%甲酸水（401842）.4.7甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑标准物质：纯度≥98%. 4.8甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝味唑标准储备溶液：1.0mg/mL.准确称取适量的甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑标准物质，分别用甲醇配成标准储备液.储备液在低于4C时可保存两个月.4.9甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑混合标准工作溶液A和B：根据需要吸取适量甲硝唑、洛硝哒唑、的混合标准工作溶液A.再吸取适量混合标准工作溶液A用甲醇稀释成甲硝唑为0.010μg/mL，洛硝 二甲硝咪唑标准储备溶液，用甲醇稀释成甲硝唑为1.0μg/mL，洛硝哒唑和二甲硝咪唑均为2.0μg/mL哒唑和二甲硝咪唑均为0.020μg/mL的混合标准工作溶液B.混合标准工作溶液A和B应现用现配.4.10甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑混合基质标准工作溶液：根据需要吸取适量甲硝唑、洛确哒唑、二
GB/T 20744-2006
1.00ng/mL、5.00ng/mL的混合基质标准工作溶液.混合基质标准工作溶液应现用现配.4.11BAKERBOND CarboxylicAcid固相萃取柱或相当者：500mg，3mL.使用前用4mL乙酸乙酯 预处理，保持柱体湿润.4.12滤膜：0.20pm.
5仪器
5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3液体混匀器.5.4固相萃取真空装置，5.5振荡器.5.6具塞玻璃离心管：50ml. 5.7真空泵：真空度应达到80kPa，5.8离心机.5.9旋转蒸发器.5.11梨形瓶：150mL. 5.10刻度样品管：5mL.
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源.5.12筒形漏斗.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀.对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60C的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温.分出0.5kg作为试样.制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记.
6.2试样保存
将试样于常温下保存.
7测定步骤
7.1提取
匀，加20mL乙酸乙酯，于振荡器上振荡20min，以3000r/min离心5min，取上清液过盛有25g无水 称取10g试样（精确到0.01g）置于50mL具塞玻璃离心管中，加人10mL水，在液体混匀器上混硫酸钠筒形漏斗至梨形瓶中.再用20mL乙酸乙酯提取一次，过无水硫酸钠简形漏斗，合并上清液，用旋转蒸发器于45C水浴上减压蒸发至约2mL，待净化.
7.2净化
形瓶和萃取柱，弃去全部流出液.在65kPa的负压下，减压抽干萃取柱2min，用2mL洗脱剂以 将上述浓缩液移至CarboxylicAcid固相萃取柱中，再分别用4mL乙酸乙酯和4mL乙晴洗涤梨≤3mL/min流速洗脱，收集洗脱液于5mL刻度样品管中，用洗脱剂定容至2mL，过0.20um滤膜，供液相色谱-申联质谱仪测定.
7.3测定
7.3.1液相色谱条件
a）色谱柱：Atlantis dCs3μm.150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）流动相：乙晴0.1%甲酸水（3070）；
c）流速：200L/min;d）柱温：30C；e）进样量：20gl.
7.3.2质谱条件
扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测：d) 雾化气压力：0.069MPa； 电喷雾电压：5500V；f) e) 气帘气压力：0.069MPa；辅助气流速：6L/min；离子源温度：700C；
a）离子源：电喷雾离子源（ESI）；g)h)i）定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量见表1.
表1三种硝基咪唑药物的质谱参数
中文名称 英文名称 定性离子对（m/z） 定量离子对（m/c） 去族电压/V 碰撞能量/V172.1/128.1 30 19甲硝唑 metronidazole 172 1/82 1 172 1/128 1 30 34201.1/140 2 26 14洛硝哒唑 ronidazole 201 1/110 1 201 1/140 2 26 20二甲硝味唑 dimetridazole 142. 2/96 1 142 2/96 1 40 22142 2/81 2 40 40
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
积为纵坐标，混合基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定 在仪器最佳工作条件下，用甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑混合基质标准工作溶液分别进样，以峰面量，样品溶液中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑的响应值均应在仪器测定的线性范围内.甲硝唑、洛硝哒甲硝咪唑的参考保留时间见表2.
表2三种硝基咪唑药物的参考保留时间
中文名称 保留时网/min甲硝唑 2 80 3.12二甲硝咪唑 洛硝哒睡 3 57
本方法的添加回收率数据参见附录B.
7.4平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定.
7.5空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验.
8结果计算
结果按式（1）计算：
