中华人民共和国国家标准
GB/T20746-2006
牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、喹乙醇 及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of the residues of carbadox olaquindox andrelated metabolites in bovine and porcine liver and muscle tissuesLC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国泰皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局.本标准主要起草人：庞国芳、谢围琪、欧阳、蓝芳、林黎、涂小珂.
本标准系首次发布的国家标准.
牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、喹乙醇 及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧及其代谢物脱氧卡巴氧、喹啉-2-酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹嗯啉-2-羧酸残留量的液相色谱-申联质谱测定方法.
本标准适用于牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧及其代谢物脱氧卡巴氧、喹畔-2-酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹啉-2-羧酸残留量的测定.
本标准的方法检出限：卡巴氧、脱氧卡巴氧、唑咳啉-2-酸和3-甲基唑咳啉-2-酸均为0.5μg/kg
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，neqISO3696：1987)
3原理
用乙睛乙酸乙酯（1十1）溶液提取肌肉和肝脏组织中的卡巴氧，提取液经正已烷脱脂后，旋转蒸发至干，残渣用甲酸（0.1%）甲醇（191）溶液溶解.样液供液相色谱-串联质谱仅测定，内标法定量.
用甲酸溶液消化试样，使组织中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后，过OasisMAX固相萃取柱或相当者净化.先用二氯甲烷洗脱脱氧卡巴氧，再用2%甲酸乙酸乙酯溶液洗脱喹咳啉-2-酸和3-甲基喹嗯啉-2-羧酸，氮气吹干洗脱液，残渣用甲酸甲醇（191）溶液溶解，样液供液相色谱-申联质谱仪测定，内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙睛：色谱纯.4.3甲酸：色谱纯.4.4正已烷. 4.5乙酸.4.6浓盐酸.4.7乙酸钠.
4.8二甲基甲酰胺.4.9乙酸乙酯.4.10中性氧化铝：200目~300目.4.12甲酸乙酸乙酯溶液：2%.向400mL乙酸乙酯中加人10mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500mL. 4.11乙腾乙酸乙酯溶液（11）.4.13甲酸落液；0.6%.量取6.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L.4.14甲酸溶液：0.1%.量取1.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L.4.15甲酸甲醇溶液（191）.用190mL甲酸溶液（4.14）与10mL甲醇（4.1）混合.4.16盐酸溶液：0.1mol/L.量取8.3mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L.4.17盐酸溶液：0.3mol/L.量取25mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L 4.18Protease蛋白酶：Sigma P5I47或相当者，-18C以下保存.4.19蛋白酶水溶液：0.01g/mL.称取1.00gProtease蛋白酶（4.18），用水溶解、定容至100mL，4C保存.4.20乙酸溶液：10%.量取100mL甲酸，用水溶解、定容至1L.4.21乙酸钠溶液：0.05mol/L，pH=7.称取6.8g乙酸钠用800mL水溶解，再滴加10%乙酸溶液 以调节溶液pH=7，用水定容至1L.4.22乙酸钠甲醇溶液（191).用190mL乙酸钠溶液（4.21）与10mL甲醇（4.1）混合.4.23甲醇水溶液（14）.4.24Tris 碱：Sigma T1503或相当者.4.25Tris溶液：1.0mol/L.称取121gTris碱，用水溶解、定容至1L，4C保存.4.26卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹咳琳-2-酸、3-甲基喹咳啉-2-酸、喹嗯啉-2-羧酸-d4标准物质：纯度 ≥99 % 4.27标准储备溶液：100mg/L.准确称取适量标准物质，卡巴氧用二甲基甲酰胺溶解定容，其余标准物质分别用甲醇溶解定容，配成100mg/L的标准储备液，在一18C保存，可使用1年.4.28基质混合标准工作溶液：根据灵敏度和使用需要，用空白样品提取液配成不同浓度（ug/L）的基质混合标准工作溶液，在4C保存，可使用1周.4.29内标工作溶液：准确称取适量内标标准物质，用甲醇溶解定容，配成100μg/L的标准工作溶液， 在4C保存，可使用1周，4.30阴离子交换柱：Oasis MAX60mg，3mL，或相当者.用前分别用3mL甲醇和3mL水活化，保持柱体湿润.4.31滤膜：0.2ym，
5仪器
5.1液相色诺-申联质谱仅：配有电喷雾离子源.5.2固相萃取装置.5.3氮气浓缩仪.5.4液体混匀器.5.5分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.6真空泵.5.7均质器.5.8移液器：10yL~100μL和 100yL~1 000yL.2
5.9聚丙烯离心管：50mL具塞.5.10pH计：测量精度士0.02pH单位.5.11低温离心机：可制冷到4C.5.12玻璃离心管：15mL.
6试样制备与保存
6.1试样的制备
将牛、猪肝脏和肌肉组织样品充分搅碎，均质，分出0.5kg作为试样，置于清洁样品容器中，密封，并做上标记
6.2试样的保存
将制备好的试样于一18C以下保存.
7测定步骤
7.1卡巴氧的前处理步骤
7.1.1称取5g试样，精确至0.01g.置于50mL聚丙烯离心管中，加人5g中性氧化铝（4.10）. 7.1.2加人25mL乙睛乙酸乙酯溶液（4.11），于液体混匀器上充分混合5min，以5000r/min离心5000r/min离心5min，弃去上层正已烷，将下层清液转移至150mL鸡心瓶中.溶液（4.29），使其浓度为2.0ng/g，40C水浴，减压旋转蒸发至干.仪测定.
5min，将上清液移取至另一干净的50mL离心管，加人10mL正已烷（4.4）到管内，振荡2min，以
7.1.3重复7.1.2步骤一次，合并两次提取液于同一鸡心瓶中，加人一定量的喹嗯啉-2-羧酸-d4标准
7.1.4准确加入1.0mL甲酸甲醇溶液（4.15）溶解残渣，过0.2gm滤膜后，供液相色谐-申联质谱
7.2.1称取5g试样，精确至0.01g.置于50mL聚丙烯离心管中，加人10mL0.6%甲酸溶液（4.13），混匀后，置于（47士3）C振荡水浴中振摇1h；先加人3mL1.0mol/LTris溶液（4.25）混匀，再加人0.3mL蛋白酶水溶液（4.19），充分混匀后，置于（47±3）C振荡水浴中酶解16h~18h.加入20 mL0.3mol/L盐酸溶液（4.17），振荡5min，在10C以5000r/min离心15min，上清液过滤.
7.2.2将滤液（7.2.1）移入OasisMAX固相萃取柱（4.30）中，待样液全部流出后，用30mL乙酸钠十甲醇溶液（4.22）淋洗固相萃取柱，真空抽干15min.
7.2.3在一支干净的玻璃管内加入一定量的喹嗯啉-2-酸-d4标准溶液（4.29），使其浓度为2.0ng/g，再用4X3mL二氯甲烷将脱氧卡巴氧洗脱至管内，在45C用氮气浓缩仪吹干.
7.2.4固相萃取柱再用3×3mL甲醇、3mL水、3×3mL0.1mol/L盐酸溶液（4.16）和2×3mL甲醇水溶液（4.23）分别淋洗，真空抽干15min，然后用2mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，弃去全部淋 出液，最后用3mL甲酸乙酸乙酯溶液（4.12）洗脱喹咳啉-2-酸和3-甲基喹暖啉-2-酸到7.2.3所用试管中，在45C用氮气浓缩仪吹干.准确加人1.0mL0.1%甲酸甲醇溶液（4.15）溶解残渣，过0.2pm滤膜，供液相色谱-申联质谱仪测定.
7.3色谱测定
7.3.1液相色谱条件
a）色谱柱：Inertsil ODS-3，3pm，100mm×2.1 mm（内径）或相当者；b）流动相：甲醇、乙睛以及0.1%甲酸溶液，梯度洗脱条件见表1；c）流速：0.2mL/min
