中华人民共和国国家标准
GB/T 20750-2006
Determination of flunixin meglumine residuein bovine muscle tissueLC-UVmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局.本标准主要起草人：庞国芳、李军、宋文斌、董振霖、李一尘、薛大方、于一茫.
本标准系首次发布的国家标准.
牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法
1范围
本标准规定了牛肌肉中氟胺烟酸残留量的液相色谱-紫外检测法.本标准适用于牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定.本标准的方法检出限为：0.005mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测定方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测定方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，neq ISO 3696:1987)
3原理
样品中氟胺烟酸采用葡萄糖苷酸酶降解，然后用乙睛提取、浓缩，磷酸盐缓冲溶液溶解，SPE-C18净化和富集，利用适当的洗脱溶剂对固相萃取柱上富集的组分进行选择性淋洗，通过高效液相色谱的紫外检测器进行分析测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲酸，4.3p葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase)15000U/mL:例如：p-葡萄糖苷酸酶（600 000U/g），准确称取 4.2冰乙酸.0.0500gβ-葡萄糖苷酸酶于5mL玻璃试管中，加2mL的磷酸盐（PBS）缓冲溶液溶解，用0.45μm尼龙滤膜过滤，使用前现配制.4.4葡萄糖.4.5浓盐酸. 4.6流动相A：乙酸铵0.05mol/L，pH5.0：准确称取3.90g乙酸铵于1000mL的烧杯中 加 900mL水溶解并用甲酸调整至pH5.0，转移至1000mL容量瓶中，使用前过0.45gm滤膜.4.7流动相B：甲醇，色谱纯.4.9混合流动相：将40mL流动相B.30mL流动相C以及30mL流动相A相混合. 4.8流动相C：乙睛，色谱纯.4.10磷酸盐（PBS）缓冲溶液：称取0.8g氯化钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，0.115g磷酸氢
二钠和o.02g葡萄糖于250mL烧杯中加约90mL的水溶解，用0.1mol/L磷酸调整pH6.0，转移至
100mL容量瓶中并稀释至刻度.4.1185%磷酸.4.12乙酸钾溶液：0.04mol/L.称取1.95g乙酸钾于500mL容量瓶中，加约450mL水溶解并稀释 至刻度.4.13氯化钾.4.14磷酸二氢钾.4.15磷酸二氢钾缓冲溶液：0.25mol/L，pH7.0.称取17.01g磷酸二氢钾溶于400mL水中，定容到500mL，然后用0.25mol/L磷酸氢二钠调节pH至7.0（约500mL），定容到1 L. 4.16氯化钠.4.17无水磷酸氢二钠.4.18磷酸氢二钠溶液：0.25mol/L.称17.75g磷酸氢二钠溶于400mL水中，定容到500mL.4.19乙酸正已烷溶液：乙酸正已烷（1090）.4.20正己烷：色谱纯. 4.21标准物质：氟胺烟酸，纯度>99%.4.22标准储备液：50μg/mL.称取适量的氟胺烟酸标准物质，用甲醇配成50μg/mL的标准储备液.2C~4C保存，有效期为3个月.4.23标准工作溶液：2μg/mL.吸取适量的氟胺烟酸的标准储备液（4.22），用甲醇配制成2μg/mL 注：称取标准物的质量是按纯度修正过的质量.的混合标准工作溶液，2C～4C保存，有效期为1个月.4.24标准基质溶液：根据氟胺烟酸的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配制成不同浓度（μg/mL）标准基质溶液.
5仪器
5.1液相色谱仪：配有紫外检测器.5.2电子天平：感量为0.01g和0.0001g.5.3离心机：最大转速为10.000r/min. 5.4离心管：50mL聚丙烯离心管.5.5均质机.5.6振荡器.5.8氮气浓缩仪. 000~000 001~ 0幕95.9酸度计：测量精度为士0.02.5.10样品过滤器；PTFE 0.45pm.5.11固相萃取柱：Bond Elut CertifyIl，3mL 200mg或相当者.5.12真空固相萃取装置，5.13旋转蒸发仪.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
去掉牛肌肉中的骨头和皮，将其搅拌均匀，分出0.5kg作为试样，将制备好的试样密封，并贴上标签.
6.2试样的保存
将试样置于一18C条件下贮存.
7分析步骤
7.1提取
称取2.0g试样，于50mL聚丙烯离心管中，加入乙酸钾溶液（4.12）5mL，高速族涡混合10s.混合后向样品中加人30gL乙酸，调节样品pH至4.5，旋涡混合.再加人70gL新配制的β-葡萄糖苷酸酶溶液（4.3）混合，于振荡器37C条件下低速振荡16h.分别向样品中加人5mL乙睛，旋涡混合5s，离心10min（3200r/min）.转移上清液至50mL离心管中.在原液中加人5mL乙晴和1mL乙酸钾溶液（4.12）旋涡混合，离心，将上清液转移至50mL离心管中，合并上清液，待净化.
7.2净化
在混合的上清液中加人5mL正己烷和50pL浓盐酸，旋涡混合15s，离心5min（3200r/min）.弃去正已烷层，重复上述步骤一次.55C条件下氮吹使其体积小于5mL，加入磷酸二氢钾缓冲溶液（4.15）7mL，旋涡混合，超声20s，5C条件下离心15min（3200r/min）.采用固相萃取柱（5.11），用3mL甲醇和3mL水活化柱，将样品过柱，弃去过柱液，然后用3mL水和6mL甲醇洗柱，弃去过柱 液.加大真空度抽滤10min.用2mL正已烷淋洗柱子两次并弃去淋洗液.用2mL乙酸正已烷溶液（4.19）洗提柱子两次，用15mL离心管收集洗脱液.在55C条件下将洗脱液氮吹至干.随后，在每个样品中加入混合流动相（4.9）1mL，旋涡混合5s，超声5s.样液用0.45pm的滤膜过滤到进样瓶中，待测.
7.3测定
7.3.1液相色谱测定条件
a）色谱柱：Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm，或相当者；b）流速：0.4mL/min;c）检测波长：285nm; d）柱温：35C；e）进样量：20μL;f）运行时间：20min：g）延迟时间：10 min.
7.3.2液相色谱测定
用氟胺烟酸的标准基质溶液（4.24）分别进样，以峰面积和工作标准溶液浓度绘制标准工作曲线，样品溶液中氟胺烟酸的响应值应在仪器测定的线性范围内.在上述色谱条件下，氟胺烟酸保留时间约为13.0min，标准物质色谱图参见图A.1.氟胺烟酸的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1.
7.4平行试验
按照上述步骤，对同一试样进行平行试验.
7.5回收率试验
空白样品中添加标准溶液按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率.
8结果计算
按式（1）计算试样中氟胺烟酸的残留量：
(1）
式中：
X-试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）：（--从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
