中华人民共和国国家标准
GB/T20756-2006
可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、 甲矾霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of chloramphenicol.thiamphenicol.andflorfenicol residues in edible animal muscles，liver and aquatic productsLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局.本标准主要起草人：庞国芳、林海丹、林峰、焦红、陈捷.
本标准系首次发布的国家标准.
可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、 甲矾霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了可食动物肌肉、肝脏、鱼和虾中氯霉素、甲润霉素和氯苯尼考残留量的液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于可食动物肌肉、肝脏、鱼和虾中氯霉素、甲霉素和氟苯尼考残留量的测定.
本标准方法的检出限：氯霉素为0.1pg/kg，甲矾霉素和氟苯尼考为1.0μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004 ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，neqISO3696：1987)
样品中的氯霉素、甲霉素和氟苯尼考在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液旋转蒸干后，残渣用水溶解，经正已烷液液分配脱脂，液相色谱-申联质谱仪检测.
4试剂
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯. 4.2乙酸乙酯.4.3正已烷.4.4氢氧化铵：25%~28%.4.5无水硫酸钠：经650C灼烧4h.置于干燥器中备用，4.7尔代氯霉素内标标准溶液：100ug/ml. 4.6氯霉素、甲枫霉素和氟苯尼考标准物质：纯度≥99.5%4.8标准储备溶液：100μg/mL，分别准确称取适量的氯霉素、甲霉素和氟苯尼考标准物质，用甲醇配成100ug/mL的标准储备溶液，该溶液于-18C保存，可使用1年.4.9混合标准储备溶液：1μg/mL.分别准确吸取1mL氯霉素、甲枫霉素和氟苯尼考标准储备溶液4.10中间浓度混合标准溶液：20ng/mL.准确吸取1mL混合标准储备溶液（4.9）于50mL容量瓶 （4.8）于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，该溶液于一18C保存，可使用6个月.
中，用水稀释至刻度，该溶液于4C保存，可使用3个月.
GB/T 20756-2006
4.11内标标准储备溶液：1pg/mL.准确吸取100L氯代氯霉素（d-氯霉素）标准溶液（4.7）于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度.该溶液于一18C保存，可使用6个月.4.12中间浓度内标溶液：20ng/ml.准确吸取1mL内标标准储备溶液（4.11）于50mL容量瓶中，4.13基质混合标准工作溶液：根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的中间浓度混合标 用水稀释至刻度.该溶液于4C保存，可使用3个月.准溶液（4.10）和中间浓度内标溶液（4.12），用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液，内标浓度均为0.3ng/mL.当天配制.4.14滤膜：0.2ym
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3离心机：4 000r/min. 5.4高速台式离心机：13000r/min.5.5组织接碎机.5.6匀质器.5.7旋转蒸发器.5.8超声波.5.9液体混匀器. 5.10聚丙烯离心管：50mL，1.5mL，具塞.5.11鸡心瓶：25mL.5.12比色管：50mL，具塞，
6试样制备与保存
取样品约500g用肉类组织接碎机绞碎，装人洁净容器作为试样，密封，并标明标记.6.2试样的保存将试样于-18C冰箱中保存.
6.1试样的制备
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样，精确至0.01g.置于50mL聚丙烯离心管中，加入中间浓度内标溶液（4.12）75.0 pL，加人15mL乙酸乙酯，0.45mL氢氧化铵（4.4），5g无水硫酸钠，匀质提取30 s 以4 000 r/min离心5min，上清液转移至50mL比色管中.另取一个50mL离心管，加人15mL乙酸乙酯，0.45mL 氢氧化铵，洗涤匀质刀头10s，洗涤液移人第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，于液体混匀器（5.9）上涡旋提取1min，超声波提取5min，以4000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管中.残渣再加入15ml乙酸乙酯，重复上述操作，合并全部上清液至50mL比色管中，用乙酸乙酯定容至50mL，摇匀后移取10mL乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶中，在45C旋转浓缩至干.
7.2净化
鸡心瓶中的残渣用3mL水溶解，超声5min，加人3mL正已烷涡族混合30s，静置分层，弃掉上层的正已烷，再加3mL正已烷涡旋混合30s，静置分层，移取1mL水相于1.5mL的聚丙烯离心管中，以13000r/min离心5min，过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定.
7.3色谱测定
7.3.1液相色谱条件
a）色谱柱：Discovery C色谱柱，5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 柱温：40C；c） 流动相：甲醇水（4060)：d) 流速：0.30mL/min:e) 进样量：20yul
7.3.2 质谱条件
a) 离子源：电喷雾离子源：b) 扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）：d) 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量 电喷雾电压：-1750V；e) 以使质谱灵敏度达到检测要求：f） 辅助气温度：500℃；g）定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表1.
表1氯霉素、甲碾霉素、氟苯尼考和气代氯霉素（d-氯霉素）的质谱参数
被测物名称及内标名称 定性离子对 (m/≥) 定量离子对 (/2) 采集时间 /ms 去族电压 /V 碰撞能量 /V320 9/257. 0 55 16氯霉索 320 9/152 0 320 9/152 0 200 26甲霉素 354 0/290.0 354 0/185 0 200 55 18354 0/185 0 356 0/336 0 14 27氯苯尼考 356 0/185 0 356 0/336 0 200 55 -27代氯霉素（d-氯霉索） 326 0/157 0 326 0/157 0 200 55 26
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
7.3.3.1定性测定
组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若简差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物.
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
%
相对离子丰度 >50 >20~50 >10~20 ≤10允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50
7.3.3.2定量测定
代氯霉素（d-氯霉素）峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度与尔代氯霉素（d-氯霉素）浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应 在仪器测定的线性范围内.内标法定量.氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和尔代氯霉素（d-氯霉素）的标准物质的多反应监测（MRM）色谱图参见图A.1.氯霉素、甲矾霉素和氟苯尼考的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1.
