中华人民共和国国家标准
GB/T20766-2006
牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for determination of zearalanol zearalanone diethylstilbestrol hexestrol and dienoestrol multi-residuesin bovine and equine liver kidney and muscle-LC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国泰皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局.本标准主要起草人：庞国芳、许泓、林安清、古珑、何佳、张曼.
本标准系首次发布的国家标准.
牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留
量液相色谱-串联质谱测定方法.
量的测定. 本标准适用于牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留
本标准的方法检出限：牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚为0.5pg/kg己烯雌酚和双烯雌酚为1.0μg/kg.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，neqISO3696：1987)
冲溶液加酶解剂分别提取，硅胶固相萃取柱净化后浓缩，用液相色谐-申联质谱仪测定，保留时间和离子 试样中残留的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚用叔丁基甲基醚和乙酸盐缓丰度比定性，内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1叔丁基甲基醚：色谱纯.4.2乙酸：优级纯.4.3乙酸钠（CHCOONa3H;O).4.4乙酸盐缓冲溶液：0.2mol/L，pH=5.2.称取2.72g乙酸（4.2）和12.95g乙酸钠（4.3）溶解于800mL水中，用氢氧化钠溶液（4.6）调节pH值至5.2土0.1，加水定容至1000ml. 4.5氢氧化钠：优级纯.4.6氢氧化钠溶液：3mol/L.称取120g氢氧化钠（4.5）溶于1000mL去离子水中.4.7甲醇：色谱纯.
GB/T 20766-2006
4.8乙晴：色谱纯.4.9乙酸乙酯：色谱纯.4.10正已烷：色谱纯 4.11二氯甲烷：色谱纯.4.12溶解液：正已烷二氯甲烷（6040）.量取60mL正己烷（4.10）与40mL二氯甲烷（4.11）混合.4.13淋洗液：乙酸乙酯正己烷（694）.量取6mL.乙酸乙酯（4.9）与94mL正已烷混合.4.15β-葡糖苷酸酶：H-2型，含β-葡糖苷酸酶124400units/mL，硫酸酯酶3610units/mL. 4.14洗脱液：乙酸乙酯正己烷（6040）.量取60mL乙酸乙酯与40mL正已烷混合.4.16激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇（包括a玉米赤霉醇和3-玉米赤霉醇，各50%），纯度97%；玉米赤霉酮，纯度>97%；己烯雌酚，纯度≥99%：已烷雌酚，纯度≥98%：双烯雌酚，纯度98%.4.17激素及代谢物标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准物质，用甲醇（4.7）配制成1.0mg/mL标准储备溶液.再根据需要以甲醇配制成不同浓度 的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4C冰箱中，可使用三个月.4.18内标标准物质：尔代玉米赤霉醇（包括a-玉米赤霉醇-4氛代和g-玉米赤霉醇-4氯代，各50%），纯度≥99%：己烯雌酚-8氛代，纯度≥98%.4.19内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉醇-4尔代和己烯雌酚-8氯代标准物质，用甲醇分别配制成1.0mg/mL内标标准储备溶液.再以甲醇稀释成与5ng/mL玉米赤酶醇和己烯雌酚峰面积或峰高 相当浓度的混合内标标准工作溶液，保存于4C冰箱中，可使用三个月.4.20硅胶固相萃取柱：500mg，3mL.使用前用6mL正已烷分两次预洗硅胶柱，流速均为4 mL/min 4.210.45 yum 滤膜.
5仪器
5.1液相色诺-串联质谱联用仪：配有大气压化学电离源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3自动固相萃取仪或固相萃取装置.5.4高速均质器；转速大于10000r/min. 5.5氮气浓缩仪，5.6涡旋振荡器.5.7离心机：转速大于3000r/min.5.8pH计：测量精度土0.2pH单位.5.9具塞试管：25mL.50mL. 5.10微量注射器：25yL，100pL.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
取有代表性样品500g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品.试样分为两份，置于样品盒中，密封，并做上标记.
6.2试样保存
制备好的试样置于一18C冰柜保存.
7测定步骤
7.1基质混合标准溶液的制备
7.1.1试样的称取
称取5个阴性样品，每个样品为5g（精确到0.01g），置于50mL离心管中，分别加入不同量混合标准工作溶液（4.17）、使玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚的浓度为1.25ng/mL、2.5ng/mL、5. 0 ng/mL、12. 5 ng/mL、25ng/mL;己烯雌酚和双烯雌酯的浓度为 2. 5ng/mL、5. 0ng/mL、10 ng/mL.25ng/mL、50ng/mL，再分别加入适量内标标准溶液（4.19），使内标物浓度均为 10 ng/mL
7.1.2提取
加人20mL叔丁基甲基醚（4.1），在10000r/min转速下高速均质（5.4）1min.3000r/min离心（5.7）5min，将上清液全部转移至另一50mL具塞试管（5.9）中备用.离心管中的残渣置于通风翻中转移至另一25mL具塞试管（5.9）中，并在氮气浓缩仪（5.5）上于40C水浴中吹去残余权丁基甲基醚 挥发30min，加人15mL乙酸盐缓冲液（4.4），高速均质1min，3000r/min离心5min，将上清液全部后，加人80alg葡糖苷酸酶（4.15）混匀，于52C烘箱中放置过夜.在此缓冲溶液中加入氢氧化钠溶液（4.6）将溶液pH值调至7.加人10mL叔丁基甲基，充分混合，3000r/min离心2min.移取叔丁基甲基醚层与前述的权丁基甲基提取液混合，在氮气浓缩仪上于40C水浴中吹干，加人1mL溶解 液（4.12），涡旋30s溶解，待净化.
7.1.3净化
把样液转入硅胶固相萃取柱（4.20），流速为2mL/min，在样品试管中加人3mL淋洗液（4.13），混合后过柱，流速为2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加人2mL空气以4mL/min的速度吹过硅胶柱.用6mL洗脱液（4.14）洗脱，流速为2mL/min，加人2mL空气以6mL/min的速 度吹过硅胶柱，收集洗脱液.将洗脱液在氮气浓缩仪上于40C水浴中吹干，加人1mL流动相，涡旋30s溶解，溶液经滤膜（4.21）过滤后，供液相色谱-申联质谱测定，
7.2试样溶液的制备
2.0μg/kg.按7.1.2和 7.1.3操作. 称取待测样品5g（精确到0.01g）于50mL离心管中，加人内标标准工作溶液，使内标物含量均为
7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确到0.01g）于50mL棕色离心管中，按7.1.2和7.1.3操作.
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：ZORBAX Eclipse SB-C ，3.5μm，150 mm× 4.6 mm 或相当者：b）柱温：25C；c）流动相：乙晴水（7030）；d）流速：1.0mL/min; e）进样量：50gl
7.4.2质谱条件
a）离子化方式：大气压化学电离；b）扫描方式：负离子扫描；c）检测方式：多反应监测（MRM）；d）离子源温度：325C： e）雾化气压力：0.1035MPa；f）气帘气压力：0 0690MPa；
