中华人民共和国国家标准
GB/T20767-2006
牛尿中玉米赤霉醇、已烯雌酚、 已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for determination of zearalanol diethylstilbestrolhexestrol and dienoestrol multi-residues in bovine urine-LC-MS-MS method
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录，本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局.本标准主要起草人：庞国芳、许泓、林安清、古珑、何佳、张曼.
本标准系首次发布的国家标准.
牛尿中玉米赤霉醇、已烯雌酚、 已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛尿中玉米赤霉醇、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定.
本标准的方法检出限：玉米赤霉醇和己烷雌酚为0.5μg/L，已烯雌酚和双烯雌酚为1.0μg/L.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004 ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T66821992，neqISO3696:1987)
3原理
免疫亲和柱内含有的特异性抗体选择性地与试样中已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚和玉米赤霉醇结合，形成抗体-抗原复合体，用水淋洗柱除去杂质，用洗脱剂洗脱吸附在柱上的目标物，收集洗脱液.试液用液相色谱-申联质谱仪测定，保留时间和离子丰度比定性，内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯. 4.2乙醇：色谱纯.4.3乙晴：色谱纯.4.4淋洗液：将Randox试剂盒中提供的淋洗原液用去离子水按1：20稀释.4.6储备液：将Randox试剂盒中提供的储备原液用去离子水按1：5稀释. 4.7免疫亲和层析柱：Randox或相当者.4.7.1玉米赤霉醇免疫亲和层析柱：亲和柱的最大容量为100ng玉米赤霉醇.4.7.2二苯乙烯免疫亲和层析柱：亲和柱的最大容量为50ng已烯雌酚，50ng已烷雌酚，50ng
4.5洗脱液：乙醇水（7030）.量取70mL乙醇（4.2）与30mL去离子水混合.
1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他产品能有相同的效果.则可使用这些等效的产品.
GB/T 20767-2006
双烯雌酚.4.8激素标准物质：玉米赤霉醇（包括α玉米赤霉醇和玉米赤霉醇，各50%），纯度≥97%；已烯雌酚，纯度>99%：已烷雌酚，纯度≥98%：双烯雌酚，纯度≥98%.4.9激素标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、已烯雌酚、已烷雌酚和双烯雌酚标准物质，用甲 醇（4.1）配制成1.0mg/mL标准储备溶液.再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4C冰箱中，可使用三个月.4.10内标标准物质：玉米赤霉醇-4氛代（包括α玉米赤霉醇-4氛代和β玉米赤霉醇-4氟代，各50%），纯度≥99%；己烯雌酚-8氰代，纯度≥98%4.11内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉醇-4氛代和已烯雌酚-8氯代标准物质，用甲醇分别配制 成1.0mg/mL标准储备溶液.再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标标准工作溶液，保存于4C冰箱中，可使用三个月.
4.12滤膜：孔径0.45m.
5仪器
5.1液相色诺-串联质谱联用仪：配有大气压化学电离源.5.2离心机：转速大于3000r/min.5.3氮气浓缩仪.5.4涡旋振荡器.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
取有代表性样品，制成实验室样品.试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记.
将试样置于2C~8C下保存.
7测定步骤
7.1基质混合标准溶液的制备
7.1.1样品称取
取5个阴性牛尿样品，每个10mL，于50mL离心管中，3000r/min离心（5.2）15min.向5支1. 25ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL：己烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5 ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25 ng/mL、50ng/mL.再分别加入适量混合内标标准溶液（4.11），使其浓度均为10ng/mL.加人3mL离心后牛尿的上清液，涡旋（5.4）30s溶解，待净化.
7.1.2净化
用15mL淋洗液（4.4）分两次预洗免疫亲和层析柱（4.7），流速不大于3mL/min.上样，自然流速.用5mL淋洗液以不大于2mL/min的速度淋洗，等体积重复淋洗一次，再用5mL去离子水以不大于2mL/min的速度淋洗.用4mL洗脱液（4.5）洗脱，流速不大于2mL/min，收集洗脱液.将洗脱液在氮气浓缩仪（5.3）上于40C水浴中吹干，加入1mL流动相，涡旋30s溶解.溶液经滤膜（4.12）过滤后，供液相色谱-申联质谱测定.
7.2试样溶液的制备
取经3000r/min离心15min后待测样品3mL于50mL离心管中，加人内标标准工作溶液，使其含量均为2.0μg/kg.按7.1.1和7.1.2操作.
7.3空白基质溶液的制备
取经3 000 r/min离心15min后阴性样品3mL于50mL离心管中，按7.1.1和7.1.2操作.
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：ZORBAX Eclipse SB-C，3.5μm，150 mm×4.6mm或相当者;b）柱温：25C；c）流动相：乙晴水（7030)；d) 流速：1.0mL/min:进样量：50L.
7.4.2质谱条件
a) 离子化方式：大气压化学电离：b) 扫描方式：负离子扫描；c) 检测方式：多反应监测（MRM）；d) 离子源温度：325C： 雾化气压力：0.1035MPa；f) e) 气帘气压力：0.0690MPa；g) 辅助气压力：0.2415MPah) 喷雾器电流：-5pA；电喷雾电压：-4500V；j）定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去额电压见表1.
表1四种激素和两种内标物的定性离子对、定量离子对碰撞气能量和去簇电压
药物名称 定性离子对（m/=） 定量离子对（m/z) 碰撞气能量/V 去族电压/V321 1/277 2 35 100玉米赤霉醇 321 1/303. 2 321 1/277 2 35 100玉米赤霉醇-4筑代 325 1/208 9 325 1/263 1 36 100325 1/263 1 38 100已烯维酚 267 0/222 1 267 0/222. 1 40 90 267 0/237 1 40 90双烯维酚 265 0/221 1 265 0/235 1 32 35 90269 0/119. 0 265 0/235 1 22 90 75己烷雕船 269 0/134 0 269 0/134 0 46 75275 1/227 9 40 73已烯维酚-8氛代 275 1/245 0 275 1/245 0 40 74
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在土2.5% 每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质和内标物的之内：样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物.
