中华人民共和国国家标准
GB/T21103-2007
动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性 检测方法实时荧光PCR方法
Identification of mammal derived materials in animal-originated feedstuffsReal time PCR method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口.
本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程（大连）有限公司、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局.
宗卉、金东权. 本标准主要起草人：曹际娟、李品泉、郑秋月、徐昊、张舒亚、于爱画、王玉萍、陈颖、徐宝梁、高宏伟、
本标准首次发布.
动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性 检测方法实时荧光PCR方法
1范围
本标准规定了动物源性饲料中哺乳动物源性成分（包括牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗、猫等）实时荧光PCR检测方法，该检测方法的检出限为0.1%.
本标准适用于动物源性饲料中哺乳动物源性成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/T 14699.1-2005 1SO6497:2002 IDT)
SN/T1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
实时荧光PCRreal timePCR
实时荧光聚合酶链式反应.
3. 2
Ct 值cycle time
每个反应管内的荧光信号达到设定的闺值时所经历的循环数.
4原理
采用TagMan实时荧光PCR技术.根据线粒体DNA的12S 核糖体RNA（12Sribosomal RNA，12SrRNA）基因上哺乳动物与非哺乳动物种间序列差异而进行哺乳动物源性成分鉴定.利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增.以实时荧光检测技术，采用多重PCR方法，将所用试剂配制成预混合形式，组建成实时荧光PCR哺乳 动物DNA检测试剂盒.在同一反应管内对哺乳动物的12SrRNA基因及内参照基因同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein，FAM）、5-六氯荧光素（5-hexachlo-ro-fluorescein，HEX）的探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测.其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果.观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对动物源性饲料中哺乳动物源性成分进行快速检测.
5试剂与材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求.
GB/T 21103-2007
5.1DNA提取用试剂
5.1.1三氯甲烷.5.1.2异戊酶.5.1.3异丙醇， 5.1.470%乙醇.5.1.5裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05mol/LNaCl 0 01 mol/L EDTA(pH8 0)(ethylene diaminetetraacetic acid 乙 胺四 乙酸).5. 1. 6TE 缓冲液(Tris-HC1 EDTA 缓冲液): 10 mmol/L Tris-HCl(pH8. 0) 1 mmol/L EDTA
(pH8.0).
5.2实时荧光PCR哺乳动物DNA检测试剂盒
5.2.12×哺乳动物源性检测预混合液
含有 Ex Tag HS（终浓度 1.25 U/25 μlL）、dNTPs（终浓度各 0. 4 mmol/L）、Mg²（终浓度3 mmol/L).
5.2.2哺乳动物源性检测引物混合液
含有扩增哺乳动物基因组DNA及内参照的引物（序列详见表1）、内参照（ADNA）.各引物终浓度0. 1 μmol/L~1. 0 μmol/ L
表1哺乳动物及内参照引物序列
名称 序列哺乳动物5-引物-1 5′-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3′哺乳动物5-引物-2 5′-AGTGCTTAATTGAACAAGGCCATG-3哺乳动物5'-引物-3 5′-AGTGCTTGATTGAATAAGGCCATG-3哺乳动物5'-引物-4 5′-AGAGCTTAATTGAATCAGGCCATG-3′哺乳动物5-引物-5 5′-AGAGCTTAATTGAATAGGGCCATG-3′哺乳动物5'-引物-6 5′-AGAGCTCAATTGAATCGGGCCATG-3′哺乳动物3'-引物-1 5'-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3哺乳动物3-引物-2 5'-TTACCTTGTTACGACTTGTCTCCT-3′内参照5-引物 5′-GGCTGATTGACCGGCAGATTA-3′- 5′-GCGGGTATAGGTTTTATTGATGGC-3′
5.2.3哺乳动物源性检测探针混合液
含有检测哺乳动物基因组DNA的探针及检测内参照的探针（序列详见表2）.探针浓度与使用的实时荧光PCR扩增仪、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行.
表2哺乳动物及内参照探针序列
名称 序列哺乳动物探针 5′(FAM}-CGCACACACCGCCCGTCACCC -3’(Eelipse)内参照探针 5′(HEX)-CCGCCACGACGATGAACAGACGCT 3′(Edlipse)
用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照.
5.2.4阳性对照
5.2.5双蒸水.
6仪器与设备
6.1实时荧光PCR检测系统.6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.6.3电子天平：感量0.01g6.4离心机：离心力12000g. 0~~~00~96.6实时荧光PCR反应管.6.7恒温水浴箱.
7试样的选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用.
8检验步骤
8.1DNA提取
称取适量饲料（饲料粒度为100目称取50mg：60目称取100mg：20目称取200mg）于1.5mL离5min，吸取上清液至一新离心管中，加 400gl三氯甲烷异戊醇（241），充分混匀；12000r/min离 心管中，加入600μL~800μL裂解液，65C 30 min 期间每隔 10 min 振荡混匀；12 000r/min 离心心5min，吸取上清液至一新离心管中，加0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1h~2h：12000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加人50pLTE，溶解沉淀.
也可用等效的DNA提取试剂盒提取模板DNA.
8.2DNA浓度和纯度的测定
280nm处的吸光值A和A.DNA的浓度按式（1）计算： 取5gLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和
式中：
（DNA浓度，单位为微克每微升（μg/uL）；A-260nm处的吸光值；N核酸稀释倍数. 当A/A比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增.
8.3实时荧光PCR检测
8.3.1反应体系的体积为25uL，2×哺乳动物源性检测预混合液加12.5pL，哺乳动物源性检测引物混合液和哺乳动物源性检测探针混合液各加1L，样品DNA（1ng/uL~100ng/pL)1L 加双蒸水至25 μL.
8.3.2在各实时荧光PCR反应管中加人上述试剂后，盖紧管，离心5s~10s.
8.3.3将离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序.
8.3.4实时荧光PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为：95C10s，1个循环；95C5s 60C30s，40个循环，在每次循环的退火时收集荧光.
