中华人民共和国国家标准
GB/T21319-2007
Determination of avermectins residues in foodstuffs of animal originEnzyme linked immunosorbent assay
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.本标准起草单位：中国农业大学、中国检验检疫科学研究院. 本标准主要起草人：沈建忠、史为民、万字平、何方洋、吴聪明、张素霞、冯才伟、彭涛、国伟.
动物源食品中阿维菌素类药物 残留的测定酶联免疫吸附法
1范围
本标准规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量的酶联免疫吸附测定法.本标准的方法检测限：阿维菌素类药物在牛肝组织和牛肉组织中的检测限均为2pg/kg. 本标准适用于牛肉和牛肝中阿维菌素、伊维菌素和埃普利诺菌素残留量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992neqISO3696：1987)
3原理
的偶联抗原竞争阿维菌素抗体，加人酵标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应.用酶标仪在 采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上包被偶联抗原，试样中残留的阿维菌素类药物与酵标板上450nm处测定吸光度，吸光值与阿维菌素类药物残留量成负相关，与标准曲线比较即可得出阿维菌素类药物残留含量.
4试剂和材料
4.1阿维菌素类药物试剂盒4.1.196孔板（12条×8孔）包被有阿维菌素偶联抗原.4.1.2阿维菌素标准溶液（至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白）.4.1.3阿维菌素抗体溶液.4.1.5底物显色溶液A液：过氧化尿素， 4.1.4过氧化物酶标记物.4.1.6底物显色溶液B液：四甲基联苯胺.4.1.8缓冲液（2倍浓缩液）.4.1.9洗涤液（20倍浓缩液）. 4.2乙晴、正已烷、无水硫酸钠（分析纯）.4.3碱性氧化铝柱Sep-Pak Vac 12 cc(2g）.4.4水：GB/T6682规定的一级水.水），用于溶解干燥的残留物，缓冲液工作液在4C可保存一个月.份水），用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4C可保存一个月.
4.1.7反应终止液：1mol/1硫酸.4.5缓冲液工作液：用水将2倍的浓缩缓冲液按1：1体积比进行稀释（1份2倍浓缩缓冲液1份4.6洗涤液工作液：用水将20倍的浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20倍浓缩洗涤液19
5仪器
5.1酵标仪（配备450nm滤光片）. 5.2超声波清洗器.5.3离心机5.4氮气吹干仪.5.5匀浆机.5.6振荡器. 5.7涡旋式混合器.0~00008
6试样制备与保存
取新鲜或解冻的动物组织，剪碎，10000r/min匀浆1min.一20C下保存.
7试样测定
7.1提取
称取牛肉、牛肝试样3.0g士0.05g于50mL聚苯乙烯离心管中.加9mL乙腊、3mL正己烷，置于振荡器上振荡10min，加3g无水硫酸钠，再振荡10min.3000r/min以上，15C离心10min，去除上层 正已烷，取下层4.0mL提取液备用.
称取3g无水硫酸钠平铺在碱性氧化铝柱Sep-PakVac上，加10mL乙晴洗柱.再加4.0mL提取试管中，于50C~60C水浴氮气流下吹干.
取1.0mL缓冲液工作液溶解干媒的残留物，涡动1min.超声10min，涡动1min.取溶解后的样品液100L加人100μL缓冲液工作液，充分混合，取20uL用于分析.
7.2测定
使用前将试剂盒在室温（19C~25C）下放置1h~2h.7.2.1将标准和试样（至少按双平行实验计算）数量的孔条插入微孔架，记录标准和试样的位置. 7.2.2加20μL系列标准溶液（4.1.2）或处理好的试样溶液到各自的微孔中.标准和试样至少做两个平行试验.7.2.4倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体.用250uL洗涤液7.2.5加100pL过氧化物酶标记物（4.1.4），37C恒温箱中孵育30min. 工作液充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上（或用洗板机洗涤）.7.2.6倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体.用250L洗涤液工作液充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上（或用洗板机洗涤）.7.2.7加50L底物显色液A液（4.1.5）和50gL底物显色液B液（4.1.6），混合并在37C恒湿箱避 光显色 15 min~30min.
7.2.3加抗体工作液（4.1.3）80gL到每一个微孔中.充分混合，于37C恒温箱中孵育30min.
7.2.8加50gL反应终止液（4.1.7），轻轻振荡混匀，用酶标仪在450nm处测量吸光度值.
8结果计算
用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）：
式中：
A-相对吸光度值.%：
B标准（试样）溶液的吸光度值：
B-空白（浓度为0的标准溶液）的吸光度值，
将计算的相对吸光度值（%）对应呵维菌素（gg/L）的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，见式（2）：
式中：
A-试样的相对吸光度值（%）对应的阿维菌素类含量，单位为微克每升（μg/L）； f-试样稀释倍数；计算结果表示到小数点后两位.阳性结果应用确证法确证.
X试样中阿维菌素类的含量，单位为微克每千克（ug/kg）：
试样的取样量，单位为克（g）.
9交叉反应
阿维菌素：100%：埃普利诺菌素：130%：伊维菌素：33%；泰乐菌素：<0.1%： 多拉菌素：5%：替米考星：<0.1%. 10精密度 本方法的报内变异系数≤30%，批间变异系数≤45%.
