中华人民共和国国家标准
GB/T21323-2007
动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱/质谱法
Determination of aminoglycosides residues in animal tissuesHPLC-MS/MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准起草单位：中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、湖南师范大学、中国检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：黄志强、林黎明、张鸿伟、张莹、陈波、彭涛、李晓娟、王美玲、颜鸿飞.
动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了动物组织中壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素10种氨基糖苷类药物残留量的高效液相色谱-中联质谱测定和确证方法，
本标准适用于动物内脏、肌肉和水产品中10种氨基糖苷类药物残留量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，neqISO3696：1987）
3原理
丁酸作为离子对试剂，高效液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量. 试样中氨基糖苷类药物残留，采用磷酸盐缓冲液提取，经过C：固相萃取柱净化，浓缩后，使用七氟
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：液相色谱级. 4.2冰乙酸：液相色谱级.4.3甲酸：液相色谱级.4.4七氟丁酸：纯度≥99%.4.5浓盐酸.4.6氢氧化钠. 4.7三氯乙酸：纯度≥99%4.8乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA）：纯度≥99%.4.9磷酸二氢钾.4.10七氟丁酸溶液（HFBA）：100mmol/L，准确量取6.5mL七氟丁酸（4.4），用水稀释至500mL（4C避光可保存6个月）. 4.11七氟丁酸溶液：20mmol/L.准确量取100mmol/L七氟丁酸溶液50mL（4.10），用水稀释至250mL（4C避光可保存6个月）.4.12磷酸盐缓冲液（含0.4mmol/LEDTA和2%三氯乙酸溶液）：准确称取磷酸二氢钾（4.9）1.36g，用980mL水溶解，用1.0mol/1的盐酸调pH到4.0，分别加人NaEDTA（4.8）0.15g和三氯乙酸4.13甲酸：0.1%（体积分数），准确吸取1.0mL甲酸（4.3）于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度， （4.7）20g，溶解混匀并定容至1000mL（4C避光可保存1个月）.混匀.
GB/T 21323-2007
4.14壮观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素、新霉素标准品：纯度范围92.0%~99%.4.1510种氨基糖苷类药物标准贮备液：分别准确称取适量的每种氨基糖苷类药物标准品（4.14），用 水溶解，配制成浓度为100μg/mL的标准贮备溶液（4C避光可保存6个月）.4.1610种氨基糖苷类药物混合标准中间溶液：分别准确量取壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素标准贮备溶液（4.15）各1.0mL，新霉素、潮霉素B、安普霉素标准贮备溶液（4.15）各5.0mL，于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成壮观霉素、双氢链霉素、链浓度为20.0ug/mL的混合标准中间溶液（4C避光可保存1个月）. 霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素浓度为4.0μg/mL，新霉素、潮霉素B和安普霉素4.1710种氨基糖苷类药物标准工作溶液：精密量取标准中间溶液（4.16）适量，用空白样品基质配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液（现用现配）.
4.18固相萃取C柱：500mg，3mL.
5仪器
5.1高效液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2高速组织搞碎机.5.3均质器. 5.4旋转蒸发器.5.5氮吹仪.5.6pH计.5.8真空系. 5.7分析天平：感量0.1mg和0.01g各一台.5.9离心机.
6试样制备与保存
6.1试样制备
作出标记，一份作为试样，一份作为留样. 样品经高速组织揭碎机均匀搞碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装人清洁容器内，加封后
6.2试样的保存
将试样于-18C下保存.
7测定步骤
7.1提取
称取约5g（精确至0.01g）试样于50mL聚丙烯离心管中，加人10.0mL磷酸盐缓冲液（4.12）均质2min，于平板振荡器上振荡提取10min，离心10min（4500r/min）.将上清液转移到另一个50mL聚丙烯离心管中.在残渣中再加入10.0mL磷酸盐缓冲液（4.12），重复上述操作，合并上清液，用 1.0mol/L的盐酸调pH值为3.5±0.2，加人2.0mL七氟丁酸溶液（4.10），涡旋混匀.
7.2净化
C固相萃取柱用3.0mL甲醇（4.1），3mL七氟丁酸溶液（4.11）淋洗后，将提取液加载在固相萃取柱上，控制流速约1滴/s.先用3mL七氟丁酸溶液（4.11）淋洗，再用每次3mL水淋洗两次，弃去淋洗 液，抽干5min.用5mL乙晴-七氟丁酸溶液（4.11）（8020，体积比）洗脱，收集洗脱液于精密刻度试管中.40C氮气流挥去部分溶剂，用七氟丁酸溶液（4.11）定容至1.0mL，涡旋混匀后，过0.2pm微孔滤膜，液相色谱-质谱/质谱测定.
7.3测定
7.3.1标准工作曲线制备
制备混合标准浓度系列，壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大00/000标准曲线.10种氨基糖苷类药物的CAS号和在7.3.2色谱条件下测得的色谱保留时间参见表B.1.
7.3.2液相色谱条件
a）色谱柱：C柱（可用IntersilODS-3，粒径5μm，柱长150mm 内径4.6mm或相当者）；b）流动相：甲醇水100mmol/LHFBA（梯度洗脱），流动相组成和洗脱梯度见表1；
表1流动相组成和洗脱梯度
时间/min 甲醇/% 水/% 100 mmol/L HFBA/%0 5 75 200 5 5 75 201 0 60 20 2012 0 70 10 2012.1 80 0 2015 0 80 0 2015 1 35 0 5 75 75 205 20
c）流速：0.3mL/min；d）柱温：30C；e）进样量：30pl.
7.3.3质谱条件
参见附录A
7.3.4液相色谱-串联质谱测定
7.3.4.1定性测定
按照上述条件测定样品和建立标准工作曲线，如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准溶（S/N>3），定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10（S/N≥10）；定性离子对的相对丰度物.10种氨基糖苷类药物标准工作溶液的定量离子对的重构离子色谱图参见图B.1~图B.10.
表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 >50% >20%~50% >10% ~ 20% ≤10%允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%
7.3.4.2定量测定
按外标法使用标准工作曲线进行定量测定.
7.4空白实验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行.
7.5结果计算
试样中每种氨基糖苷类药物残留量利用数据处理系统计算或按式（1）计算：
