中华人民共和国国家标准
GB/T21324-2007
食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物 残留量检测方法
Method for the determination of benzimidazoles residuesin edible animal muscle and liver
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D均为资料性附录.本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.本标准主要起草人：林峰、林海丹、吴映璇、张美金、谢守新、彭涛、李晓妇、邵琳智、邱月明.
食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物 残留量检测方法
1范围
本标准规定了食用动物肌肉和肝脏中苯并咪唑类药物和代谢物残留量的液相色谱-串联质谱检测方法和液相色谱检测方法.
本标准适用于液相色谱法和液相色谱-串联质谱法测定鸡肉、牛肉、猪肉、鸡肝、牛肝、猪肝中奥芬达唑、芬苯达唑及它们的代谢物奥芬达唑祺，阿苯达唑及其代谢物阿苯达唑-2-氨基、阿苯达唑亚和阿 苯达唑矾，甲苯味唑及其代谢物氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑，氟苯咪唑及其代谢物2-氨基氟苯咪唑，苯味唑及其代谢物5-羟基噻苯咪唑，噻苯咪唑酯残留量.适用于液相色谱-中联质谱法测定鸡肉、牛肉、猪肉、鸡肝、牛肝、猪肝中丙氧苯咪唑残留量、适用于液相色谱法测定鸡肉、牛肉、猪肉、鸡肝、牛肝中丙氧苯咪唑残留量.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，neqISO3696：1987)
3方法提要
试样在碱性条件下以乙酸乙酯提取、离心、浓缩后残渣以乙睛-0.1mol/L盐酸溶解，正已烷脱脂，经固相萃取柱净化，液相色谱-中联质谱仪或高效液相色谱仪测定，外标峰面积法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1乙酸乙酯.4.2正已烷. 4.3甲醇：液相色谱级.4.4乙睛：液相色谱级.4.5无水硫酸钠：经650C灼烧4h.置于干燥器内备用.4.6BHT（2.6-二权丁基对甲酚）. 4.7盐酸.4.8氢氧化钾.4.925%氨水.4.10甲酸：优级纯.4.11乙酸胺.4.121%BHT溶液：称取1.0gBHT.乙酸乙酯溶解并稀释至100mL，临用前配制. 4.130.1mol/L盐酸：量取浓盐酸8.3mL，加水稀释至1000ml.4.140.005mol/L甲酸：准确吸取188L甲酸，加水稀释至1000ml.
4.1550%氢氧化钾溶液：50g氢氧化钾溶解于100mL水中，冷却至室温后待用.4.1610%氨乙晴溶液：量取10mL25%氨水，乙睛稀释至100mL，临用前配制.4.18标准品：奥芬达唑（oxfendazole，CAS号 53716-50-0）、芬苯达唑（fenbendazole，CAS号 43210-67-9）、奥 4.170.025mol/1乙酸铵：1.93g乙酸铵溶解于1000mL水中.芬达唑（oxfendazole sulfone CAS 号54029-20-8）、阿苯达唑（albendazole CAS号54965218）、阿苯达唑-2-氨基矾（albendazole-Z-aminosulfone，CAS 号 80983-34-2）、阿苯达唑亚矾（albendazole sulfoxideCAS号 54029-12-8）、阿苯达唑祺（albendazole sulfone CAS号75184-71-3）、甲苯咪唑（mebendazole，CAS号14798000）、氨基甲苯咪唑（mebendazole-amine，CAS号52329-60-9）、羟基甲苯咪唑 （5-hydroxymebendazole，CAS号 60254-95-7）、氟苯咪唑（flubendazole，CAS号 ）2-氨基氟苯唑（2-aminoflubendlazole）、哪苯咪唑（thiabendazole，CAS号 148798）、喀苯咪唑酯（cambendazole，CAS号26097-80-3）、丙氧苯咪唑（oxibendazole，CAS号20559-55-1）标准品，含量均在98%以上，5-羟基噻苯崃唑（thiabendazole-5-hydroxy，CAS 号17450500）标准溶液浓度为 10 mg/L.
4.19标准储备液
准确称取奥芬达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、阿苯达唑、阿苯达唑-2-氨基、阿苯达唑亚祺、阿苯达唑矾、甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑、氟苯咪唑、2-氨基氟苯咪唑、噻苯咪唑、噻苯咪唑酯、丙氧苯咪唑标准品各10.0mg，分别用甲醇溶解并定容至100mL，配成标准储备溶液，浓度为100μg/mL.4.20混合标准工作溶液
根据需要，用乙晴-水（28.体积比）将标准储备液（4.19）及5-羟基噻苯咪唑标准溶液配成供液相色谱测定用的浓度为0 25.0.50.0.100 200.250pμg/L的混合标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱测定用的浓度为0、2.00、5.00、10.0、20.0、40.0μg/1的混合标准工作溶液.混合标准工作溶液使用前配制.4.21固相萃取柱：MCX固相萃取柱或相当者，150mg，6mL，使用前依次用5mL甲醇活化、5mL0.1 mol/L盐酸平衡. 4.22滤膜：0.20pm0.45pm，有机相.
5仪器
5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器. 5.3均质器.5.4涡旋振荡器.5.5离心机：转速大于或等于4000r/min5.6减压旋转蒸发仪. 5.7超声波水浴.5.8分析天平：感量0.1mg.0.01g.
6制样方法
制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化.
从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约500g，用组织揭碎机充分鹅辞均匀，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于一18C以下冷冻存放.
7分析步骤
7.1提取
称取5g样品（准确至0.01g），于50mL离心管中，加人20mL乙酸乙酯、0.15mL50%氢氧化钾（4.15）溶液和1mL1%BHT溶液（4.12）置超声波水浴中振荡5min.加人1g无水硫酸钠，均质器上2
以14 000r/min速度匀质提取30s 4000r/min离心5min，清液转移至100mL梨形瓶中；另取一离棒捣碎离心管中的沉淀，加人上述洗涤均质器刀头的碱性乙酸乙酯溶液，在涡旋振荡器上振荡2min， 置超声波水浴中振荡5min，4000r/min离心5min，清液合并至100mL梨形瓶中，38C减压旋转蒸发至干.
7.2净化
上述残渣立即用1.5mL乙晴溶解，涡旋混匀，超声5min，加入1.5mL.0.1mol/L盐酸，涡旋混匀，转移到15mL离心管，加5mL正已烷洗涤梨形瓶，合并转移到离心管中，涡旋混匀，4000r/min离 心5min，弃上层正已烷层，加人3mL正已烷重复操作一次.
脱脂后的样液加人3mL0.1mol/L盐酸，涡旋混匀，注入已处理的MCX固相萃取柱（4.21），依次用5mL0.1mol/L盐酸、5mL甲醇淋洗，15mL10%氨乙睛溶液（4.16）洗脱，洗脱液38C减压旋转蒸发至干，残渣加人0.5mL乙晴，置超声波水浴中振荡5min，加人1.5mL0.025mol/L乙酸铵（4.17），涡旋混匀，过0.45ym滤膜，供液相色谱测定.当采用液相色谱-中联质谱法测定时，吸取100gL液相测定.
8测定
8.1液相色谱-串联质谱法
8.1.1液相色谱条件
8.1.1.1色谱柱：C柱，50mm×2.1mm（内径）.1.8μm，或性能相当者.8.1.1.2流动相：乙晴0.005mol/L甲酸，梯度洗脱：乙：15%~80%（4min内线性增加），80%保持0.5min.80%~15%（0.01min内线性递减），15%保持3.5min. 8.1.1.3流速：0.35ml/min.8.1.1.4柱温：60C.8.1.1.5进样量：5L
8.1.2.1离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）：分辨率： 单位分辨率：其他参考质谱条件见附录A.
8.1.2.2雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求.
8.1.3液相色谱-串联质谱测定
8.1.3.1定性测定
每种被测物质选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物的保留时间与标准溶液相比在士2.5%的允许偏差之内：待测物的定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于3（S/N≥3），定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10（S/N≥10）：定性离子对的相对丰度 与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在相应的目标化合物，
表1定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 >50% %0S~%02 %0Z~%01< ≤10%允许的最大偏差 ±20% ±25 ±30 %
