中华人民共和国国家标准
GB/T21542-2008
Determination of enramycin in feeds-Microbiological method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为规范性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口.本标准起草单位：上海市兽药饲料监察所.本标准主要起草人：顾欣、蔡金华、刘雅妮、沈富林、王蓓、黄士新、金凌艳.
饲料中恩拉霉素的测定微生物学法
1范围
本标准规定了饲料中恩拉霉素的微生物学测定方法. 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中恩拉霉素的含量测定.本方法测定饲料中恩拉霉素的定量限为0.5mg/kg（500U/kg）.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（negISO3696：1987）GB/T20195动物饲料试样的制备（ISO6498：1998，IDT)
中华人民共和国兽药典（2005年版一部）
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
恩拉需素效价单位potency unit of enramycin
微生物学法测定的恩拉霉素生物活性单位用U表示.1mg恩拉霉素相当于1000U.
4原理
用酸性甲醇溶液提取试样中的恩拉霉素然后提取液用大孔吸附树脂对恩拉霉素吸附、洗脱，除去饲料中的干扰物质.利用标准溶液中恩拉霉素浓度的对数与其对敏感微生物生长抑制面产生的抑菌圈的直径成正比关系的原理制作标准曲线，根据试样液中恩拉霉素产生抑菌圈的大小来测定饲料中思拉 霉素的含量.
5试荆和材料
除另有规定外，在分析中使用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，应符合GB/T6682-1992规定的三级用水要求.
5.1甲醇溶液
甲醇-水（11）.
5.2盐酸溶液
取盐酸9mL 加水至1000mL，混匀.
5.3氢氧化钠溶液
取澄清的氢氧化钠饱和溶液112mL.加水至1000mL.混匀.
5.4洗涤液
甲醇溶液（5.1）.用氢氧化钠溶液（5.3）调节pH值至8.
GB/T 21542-2008
5.5提取液
甲醇溶液（5.1）.用盐酸溶液（5.2）调节pH值至3.
5.6洗脱液
5.7灭菌水
按附录A的规定制备.
5.8磷酸盐缓冲液（pH6.0）
按附录A的规定制备.
5.9大孔吸附树脂
多孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物树脂（AmberliteXAD-2，粒度：20目~60目，平均孔径：9nm.比表面积：300m²/g.孔容积：0.65mL/g，骨架密度：1.08g/mL.25C）.可使用参数相同的同类产品.
分混合，放置15min，小心地尽量倾去上层甲醇液，加入足量的水，搅拌混合，放置10min，备用. 将准备使用的大孔吸附树脂浸人足量的甲醇中（液面高出树脂层2cm~5cm），轻轻地搅拌，使充
5.10大孔吸附树脂层析柱
将预处理过的大孔吸附树脂（5.9）湿法装人层析柱中（高20cm，内径10mm），使柱床高度为15cm，使用25mL洗涤液（5.4）以0.4mL/min流速过柱，平衡后待用.
5.11恩拉霉素标准溶液
5.11.1恩拉霉素标准贮备溶液
称取恩拉霉素标准品（效价单位不小于900U/mg）适量，精确至0.1mg，用甲醇溶液（5.1）溶解并稀释成含恩拉霉素1000U/mL的溶液，在0C~4C可保存7d.
5.11.2恩拉霉素标准工作溶液
0.8U/mL、1.6U/mL、3.2U/mL、6.4U/mL浓度的标准工作溶液.以1.6U/mL为中心浓度标准 精确量取恩拉霉素标准贮备溶液（5.11.1)，用pH6.0磷酸盐缓冲液（5.8）稀释成0.4U/mL、工作溶液.
5.12培养基I
按附录A的规定制备.
5.13培养基Ⅱ
按附录A的规定制备.
5.14试验菌种
枯草芽孢杆菌（Baci//as sabti/is）[CMCC（B)63501或CVCC717].
5.15菌悬液
取枯草芽孢杆菌（5.14）的新鲜培养物接种于培养基I（5.12）内，在35C~37C培养7d，用灭菌水使沉淀物重悬浮，离心，重复洗涤三次，弃去洗液，最后加入适量的灭菌水制成菌悬液，此菌悬液在0C～4C可保存6个月.
5.16双碟的制备
取培养基Ⅱ（5.13）加热融化，冷却至60C，加人适量的菌悬液（以1.6U/mL中心浓度标准工作溶液产生的抑菌圈直径不小于16mm为宜），摇匀.每个双加入10mL含菌培养基，均匀摊布，放置于水平操作台上冷却，待培养基凝固后，在每个双碟内半径为2.8cm的圆周上等距离放置6个已灭菌的不锈钢小管.
6仪器与设备
6.1分析天平：感量0.0001g.
2
6.3振荡器：往复式.6.5旋转真空蒸发器. 6.4离心机.6.6电热恒温水浴锅：温度波动士1C.6.7平底双：直径为90mm，高16mm~17mm，符合中华人民共和国兽药典》2005年版一部的要求.6.9不锈钢小管：高10.0mm±0.1mm.外径8.0mm±0.1mm，内径6.0mm±0.1mm，符合《中华人民共和国兽药典》2005年版一部的要求.6.10恒温培养箱：温度波动土1C.6.11高压灭菌锅.6.12可调式微量移液器：200gL~1000gL 6.13游标卡尺（精度0.02mm）或抑菌图测定仪.
6.2天平：感量0.01g.
6.8陶瓦盖.
7试样的制备
按GB/T20195制备试样，经粉碎后全部通过1mm孔筛，混匀，装人密闭容器中备用.
8含量测定
8.1标准曲线的制备
取制备好的双（5.16）平均分为5组，标准工作溶液（5.11.2）每一个浓度为一组，每组不少于3个碟子，每个双碟的6个不锈钢小管中，间位的3个使用可调式微量移液器滴加200uL中心浓度标准工作溶液（5.11.2），另外3个滴加200gL该组浓度标准工作溶液，将双碟小心移至恒温培养箱中，盖上陶 瓦盖，于36C~37C培养16h~18h
测量各组中心浓度标准工作溶液和该组标准工作溶液的抑菌圈直径，分别计算平均值，再计算双碟中心浓度标准工作溶液抑菌图直径的总平均值，作为修正值.
各浓度组的抑菌圈直径按式（1）修正：
（1）
式中：
A--该浓度标准工作溶液被修正后的抑菌圆直径；
B修正值；
B-该浓度组中心浓度标准工作溶液所至抑菌图直径读数平均值；
A-该浓度标准工作溶液抑菌图直径读数平均值.
以各组溶液浓度的对数与该组溶液被修正后的抑菌圆直径作线性回归，求出回归方程.相关系数r应不小于0.99.
8.2试样溶液的制备
8.2.1准确称取10g的试样，精确至0.01g，置于250mL具塞锥形瓶内，加人50.0mL提取液（5.5），摇匀，调节pH至3，使用往复式振荡器振荡30min.转移至100mL离心管中，3000r/min离 心10min，取上清液过滤，将滤液用氢氧化钠溶液（5.3）调节pH至8.
8.2.2量取20.0mL滤液，以0.6mL/min的流速经过大孔吸附树脂层析柱（5.10），再用12ml洗涤液（5.4）以0.4mL/min的流速过柱，洗涤去除杂质.然后用40mL洗脱液（5.6）以0.2mL/min的流
