中华人民共和国国家标准
GB/T21674-2008
猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法
Detecting porcine circovirus with polymerase chain reaction
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准附录A为规范性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口.本标准起草单位：农业部兽医诊断中心.本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊.
引言
PCV-1）和有致病性的猪圆环病毒Ⅱ型（porcine circovirus type2，PCV-2).PCV-2是引发仔猪断奶后多 猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒I型（porcinecircovirus typel，系统衰弱综合征（post-weaning multisystem wasting syndrome PMWS）的主要病原.该病主要以患畜生长迟缓、进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，给世界各国主要养猪地区的规模化养猪业造成了一定的经济损失.
猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法
1范围
本标准规定了猪圆环病毒（PCV）聚合酶链反应（PCR）检测方法的技术要求.本标准适用于猪血清和组织中的猪圆环病毒检测，以及其I型（PCV-1）和I型（PCV-2）的鉴别.
2实验室生物安全要求
试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2级）以上的实验室进行.
3实验材料、仪器设备和试剂
3.1实验材料
眼科剪、眼科镊、称量纸、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10pL、200μL、1000pl)、灭菌双蒸水.
3.2仪器设备
仪）、液氮罐或-70C冰箱、微波炉、组织研磨器、-20C冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2μL、 分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析20 μL 200 μL 、1 000 μL).
3.3试剂
3.3.1消化液（见第A.1章）. 本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯.3.3.22%蛋白酶K溶液（见第A.2章）.3.3.3酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（见第A.3章）.3.3.510pmol/μLPCV引物（见第A.5章）. 3.3.42.5 mmol/L dNTP(见第A. 4章）.3.3.60.5U/μLTaqDNA聚合酶（见第A.6章）.3.3.710倍PCR缓冲液（见第A.7章）.3.3.8溴化乙锭（EB）溶液（见第A.8章）.3.3.9电泳缓冲液（50倍）（见第A.9章）. 3.3.101%琼脂糖凝胶（见第A.10章）.3.3.11上样缓冲液（见第A.11章）.3.3.12异丙醇.3.3.1375%乙醇（见第A.12章）.3.3.15灭菌双蒸水（见第A.14章）. 3.3.1415mmoL/L氯化镁（见第A.13章）.3.3.16电泳缓冲液（1倍）（见第A.15章）.
4操作程序
4.1样品的采集与处理
4.1.1样品的采集：濒死猪、扑杀的成年猪和流产胎儿取肺脏和淋巴结：幼龄猪取心脏：待检活猪，用注射器取血2mL~4mL，立即送往实验室.
GB/T 21674-2008
4.1.2样品的处理：每份样品分别处理
4.1.2.1组织样品处理：取待检病料约0.2g置研磨器中剪碎并研磨，加人2mL消化液（3.3.1）继续研磨.取已研磨好的待检病料上清100pL，置1.5mL灭菌离心管中，再加人500μL消化液（3.3.1）和 10pL2%蛋白酶K溶液（3.3.2），混匀后，置55C水浴中4h~16h.
4.1.2.2血清样品处理：待血液凝固后，取上清放于离心管中，4C8000g离心5min，取上清100pl，55 C水浴中 4 h~16 h.
管加人500μL消化液（3.3.1）和10L2%蛋白酶K溶液（3.3.2），混匀，置55C水浴中4h~16h.
4.1.2.4阴性对照处理：取灭菌双蒸水100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加人500uL消化液（3.3.1）10pL2%蛋白酵K溶液（3.3.2），混匀，置55C水浴中4h~16h.
4.2DNA模板的提取
4.2.1取出已处理的待检样品及阴性、阳性对照样品，每管加人600μL酚-三氯甲烷-异戊醇混合液 （3.3.3），用力原例10次混匀，13000g离心10min.4.2.2取上清500gL置1.5mL灭菌离心管中，加人等体积异丙醇（3.3.12），混匀，置液氨中3min或-70C冰箱中30min.取出离心管，室温融化.4℃20000g离心15min.4.2.3弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴人1mL-20C预冷的75%乙醇（3.3.13）溶液，轻轻旋 转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，真空抽干15min.
4.2.4取出离心管，用50gL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用.
4.3PCR扩增
每管取灭菌双蒸水8 pL，2.5 mmol/L dNTP(3.3. 4)、10 pmol/gL PCV 引物（3.3.5)、15 mmol/L2uL混匀，作好标记，加人矿物油约20μL.覆盖（有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油）.扩增 氯化镁（3.3.14)、10倍PCR缓冲液（3.3.7）、0.5U/pLTaqDNA聚合酶（3.3.6）各2L DNA模板条件为94C30s、62C45s.72C45s.35个循环后，72C延伸10min.
4.4电泳
琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入100 bpLadder Marker（分子质量标准物）.以5V/cm电压电泳40min，紫外凝胶成像仪下观察结果.
5结果判定
目的带时，实验结果成立.被检样品出现652bp扩增带为PCV-1阳性，出现1154bp扩增带为PCV-2 当PCV-1阳性对照出现652bp扩增带，PCV-2阳性对照出现1154bp扩增带，阴性对照未出现阳性，未出现相应扩增带的样品判为阴性.
