中华人民共和国国家标准
GB/T22329-2008
Diagnostic techniques for bovine hypodermosis
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B和附录C均为规范性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口，本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所.本标准主要起草人：股宏、罗建勋、关贵全.
牛皮蝇蛆病诊断技术
1范围
本标准规定了牛皮蝇塑病（bovinehypodermosis）诊断技术的要求，包括临床诊断、动物剖检和酶联免疫吸附试验（ELISA）.
本标准适用于牛皮蝇姐病的诊断.
2临床诊断及剖检检查
2.1临床诊断
牛产乳量下降，役畜的使役能力降低等症状.当皮蝇幼虫钻人脑部时，可引起神经症状，如作后退运动、 牛感染皮蝇后，一般不呈现明显的临床症状，但严重感染时，幼畜可表现出消瘦、生长缓慢、贫血，母突然地、麻痹或晕等，重者可造成死亡.此外，由于第三期幼虫在皮肤上形成穿孔，细菌感染面引起化，形成接管，常有液和浆液流出，接管逐渐愈合，形成斑痕.但上述症状只能作为诊断的参考指标，不能作为确诊的依据.只有当在牛的背部发现瘤肿状隆起和皮下蜂窝组织炎，且可挤出第三期幼虫时，方能确诊.
2.2剖检检查
当对疫区开展流行病学调查时，经常采用此方法.重点检查部位为食道黏膜、背部皮下、瘤胃浆膜、大网膜、食道浆膜等部位，如发现第一期、第二期或第三期任一阶段的幼虫，便可确诊.
2.2.1第一期幼虫的形态
呈乳白色，长3.5mm~12mm，宽0.75mm~2mm，前编稍尖.
2.2.2第二期幼虫的形态
呈浅黄白色，长11mm~15mm，宽3mm~6mm.腹面微隆，背面平.外观口钩仅见两个黄褐色的小圆点，彼此分离.
2.2.3第三期幼虫的形态
虫体长19mm~25mm，宽8mm~11mm，长宽比例（2.3~2.1）1.背面平，腹面隆起，侧面有疣状突，色泽因成熟程度不同而异，由淡黄白至淡褐色、黄褐色以至黑色，体具11节（胸部3节、腹部8节），伪头部具一对头感器，彼此分离.口钩退化为黑色圆点.
3酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）
3.1试验材料
3.1.1抗原
制备方法见附录A.
3.1.2标准阳性血清
自牛皮蝇塑病流行区颈静脉采集背部有瘤包牛的血液，分离血清，经国外商品化试剂盒检测为阳性后，按3：1（3体积血清：1体积甘油）加入甘油，混匀，分装于1.5mL离心管，-20C保存备用.
3.1.3标准阴性血清
性后，按31（3体积血清：1体积甘油）加人甘油，混匀，分装于1.5mL离心管，-20C保存备用. 自无牛皮蝇塑病流行的南方省份经颈静脉采集牛的血液，分离血清，经国外商品化试剂盒检测为阴
3.1.4酶标记二抗
辣根过氧化物标记的兔抗牛IgG，自生化试剂公司购买.
GB/T 22329-2008
3.1.5血清样品的采集和处理
颈静脉采集动物血清，加叠氮化钠（0.01%）或硫柳汞（0.01%）进行防腐，4C冷藏保存.
3.1.6溶液配制
自行配制，配置方法见附录B.
3.2操作方法
3.2.1抗原包被
用抗原包被液将抗原按使用说明稀释至工作浓度：用加样器加工作浓度抗原至ELISA反应板各孔机上按3X300pL程序，或用洗瓶重复洗涤5次. 内，每孔100uL，加盖后在37C温箱内孵育1h，然后置4C冰箱过夜；将包被液甩净，用洗涤液在洗板
3.2.2封闭
每孔加人封闭液200ul，37C温箱内孵育30min，甩干，按3.2.1方法洗涤.
3.2.3血清稀释
用血清稀释液将待检血清和标准血清作1：200稀释.
3.2.4加样
按照附录C格式每孔加100pL待检血清，试验要同时设空白对照、酶标记二抗对照、标准阳性血清对照和标准阴性血清对照.空白对照孔（A1，A2，B1.B2）和酶标记二抗对照孔（C1，C2，D1.D2）各加100uL血清稀释液加盖后37C温箱内孵育1h.用3.2.1方法进行洗涤.
3.2.5加酵标记二抗
按说明书用洗涤液将酶标记二抗稀释至工作浓度，每孔加人100pL，但空白对照孔只加相应稀释液，加盖后于37C温箱内孵育1h.用3.2.1方法进行洗涤.
3.2.6加底物
每孔加人现配制的底物溶液100uL 加盖后于37C避光温箱内孵育40min.
3.3判定
3.3.1酶联免疫检测仪测定
用空白对照调零，在405nm波长处，测定每孔的光吸收值（OD值），分别计算出每份被检样品孔、标准阳性孔和标准阴性孔的平均OD值.在P/N值（P为标准阳性血清的平均OD值，N为标准阴性血清的平均（D值）大于2时，测定结果方为有效.否则，应查明原因，重做.
3.3.2结果判定
3.3.2.1当结果有效时，利用式（1）求出OD比值.
OD比值= 待检血清样品平均OD值一标准阴性血清平均OD值
标准阳性血清平均OD值一标准阴性血清平均OD值
3.3.2.2OD比值小于或等于15%，判定为ELISA法阴性（-）；OD比值在16%~20%，判定为ELISA法疑似（士）；OD比值大于或等于21%，判定为ELISA法阳性.疑似者复检一次，仍为疑似者判为阳性，
附录A
（规范性附录）抗原的制备
A.1取100条新鲜采集或一20C保存的纹皮蝇二期幼虫，置于干净的50mL烧杯中，用剪刀剪碎.A.2加人100mLpH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS），4C搅拌过夜.A.3第二天加人15.54g硫酸铵，4C轻摇30min. A.410000r/min，4C离心20min，丢弃沉淀，收集上清液.A.5在上清液中加入15.54g硫酸铵，4C轻摇30min.10000r/min，4C离心20min，弃上清，收集沉淀，A.6将沉淀重溶于20mLpH7.2磷酸盐缓冲液中，装人透析袋，于4C在清水中搅动透析1h，然后换用pH7.2磷酸盐缓冲液，于4C透析过夜. A.7取出透析产物，10000r/min，4C离心50min.存备用.
